２０１５年第５Ｏ卷第６期 生物学通报 ５５ 第２４届国际生物学奥林匹克竞赛试题 实验１・细胞分子生物学 范六民 佟向军 许崇任 张雁云ｚ （１北京大学生命科学学院 北京 １００８７１ ２北京师范大学生命科学学院 北京 １００８７５） 中国图书分类号：Ｇ６３４．９１５ 文献标识码：Ｅ 总分：１００分。时间：９０ ｍｉｎ 本实验由２部分组成： 简介（２分） 任务１：Ｂ一葡萄糖醛酸酶的存在（１２分） １．１确定Ｂ一葡萄糖醛酸酶的存在（１２分） 任务２：周期蛋白（或周期素）前体蛋白的存 在（８６分） ２．１如何使用计数池（１分） ２．２清洗磁性小珠（磁珠） ２．３未与磁珠结合的锥虫的密度（３７．５分） ２．４全部锥虫的密度（２５．５分） ２．５ 周期蛋白前体基因的成功缺失（９分） ２．６与小珠结合的核实（９分） ２．７说明你的结果（４分） 没有单独的答题纸。请将答案填写在题目中 相应的表格方框内。 材料和设备 设备 ・３７ｏＣ水浴锅（共用） ・ＰＩＯ００微量移液器１个 ・Ｐ２００微量移液器１个 ・Ｐ２０微量移液器１个 ・Ｐ１００Ｏ枪头１盒 ・Ｐ２０和Ｐ２ｏ０枪头１盒 ・小离心管架１个 ・试管架１个 ・固体垃圾桶１个 ・废液桶（ＬＷ）１个 ・聚苯烯泡沫盒１个．内装有冰 ・计时器１个 ・记号笔１个 ・显微镜１台 ・细胞计数池３个 ・显微镜载玻片３块 ・盖玻片３片 ・小离心管（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）２１个 ・磁性小离心管架１个 ・白纸 ・呼叫助手的小旗１面 ・写有你的学生号码的黄色纸片１张 化学试剂 ・１小离心管，内装磁珠（ＭＢ） ・ｌ管磷酸盐缓冲液（ＰＢＳＢ） ・ｌ小离心管，内装固定液（ＦＢ） ・ｌ小离心管，内装底物缓冲液（ＳＢ） ・１小离心管，内装底物（Ｘ—ｇｌｕｅ）（Ｓ） 锥虫悬浮液 ・ｌ小离心管，内装品系（株）１悬浮液（Ｔ１） ・ｌ小离心管，内装品系２悬浮液（Ｔ２） ・１小离心管，内装品系３悬浮液（Ｔ３） 简介（２分） 锥虫（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）是引起人和动物睡 眠病的寄生虫，它依靠采采蝇在个体之间传播，几 乎仅在撒哈拉沙漠以南的非洲发现。为更好地了 解锥虫（ ｂｍｅｅｉ）细胞周期和感染途径所涉及的 不同蛋白的功能，现在做一些缺失周期蛋白前体， 但代之以表达另一个我们感兴趣的蛋白的锥虫突 变株。周期蛋白前体是在锥虫（ ｂｍｃｅｉ）中发现 的一种表面蛋白，但在其他种的锥虫中未发现， 推测对感染途径有影响。不同的锥虫依赖不同的 表面蛋白进行感染，例如Ｔ．ｅｏｎｇｏｌｅｎｓｅ依赖一种 称为ＧＡＲＰ的表面蛋白。 在本实验中，你的材料是锥虫亚种 ｂｍｃｅｉ ｂｍｃｅｉ株，它能够感染家畜和野生动物，但对人无 ５６ 生物学通报 ２０１５年第５０卷第６期 害。第１步，锥虫细胞被一个同时编码ＧＡＰＲ和 对３种锥虫品系Ｔｌ、Ｔ２和Ｔ３的每一种，在单 独的小离心管中分别准备下列反应混合物．并用 移液器上下吹吸以混匀。 １）２０ Ｌ的锥虫悬浮液。由于锥虫沉淀到管 底，在吸取前要颠倒几次以确保混匀。 Ｂ一葡萄糖醛酸酶２种蛋白的表达载体转染或不 被转染，并纯系培养。Ｂ一葡萄糖醛酸酶在野生型 ｂｒｕｃｅｉ中不存在，它能够切割人造底物Ｘ—ｇｌｕｃ， 生成肉眼容易观察的蓝色产物。在本实验中，Ｂ一 葡萄糖醛酸酶作为一种方便的报告基因．让你仅 需将锥虫品系与Ｘ—ｇｌｕｃ孵育（任务１），就能很容 易辨别携带有表达载体的品系。 然后对锥虫品系进行操作，删除编码周期蛋 ２）１００ Ｌ底物缓冲液（ＳＢ）。 ３）１０ Ｌ底物（Ｓ）。 在每个离心管上标记你所用的品系的名称 及由３个字母组成的你的国家号码（如同你的胸 白前体的基因。这能够确定周期蛋白前体是否对 感染很重要，以及ＧＡＰＲ是否可以补偿周期蛋白 前体的功能。由于缺失效率不是１００％，你需要将 周期蛋白前体基因被成功删除的细胞与缺失并未 发生的细胞分开。表达周期蛋白前体的锥虫与周 期蛋白前体的特异抗体共同孵育后，能够被包裹 有蛋白Ａ的磁珠分开。蛋白Ａ特异与抗体的Ｆｃ 部分结合。如下图所示： 在开始实验前，判断下列说法的正误（在你的 选项栏内打ｖ／）。（２分） Ｑ１． 正确 错误 如果一个品系的悬浮液与Ｘ－ｇｌｕｃ孵育后变蓝，则Ｂ一葡 萄糖醛酸酶基因被成功转入 如果表达载体中仅有一个基因成功插入，那么依靠报告 基因（Ｂ一葡萄糖醛酸酶）是否存在来推断ＧＡＲＰ基因是 否成功转入，就可能导致假阴性或假阳性 表达载体在基因组中的插入位置，会影响转入基因的表 达水平 如果删除的是编码细胞内某个蛋白的基因，也能用类似 的磁珠加特异抗体的方法．将成功实现基因删除的细胞 与未发生基因缺失的细胞分开 任务１：１３－葡萄糖醛酸酶的存在（１２分） １．１ 确定Ｂ一葡萄糖醛酸酶的存在（１２分） 卡所显示的那样）。 反应混合物在３７℃至少孵育１ ｈ。如你需要将 离心管放到水浴中．请在你隔墙上的管中插入小 旗示意需助手帮忙。如你需要将离心管从水浴中 拿回，也请你用小旗示意需助手帮忙。在样品孵育 时，请进行其他实验。 将你的离心管放置在相应格中写有你的学生 号码的黄色纸片上，它们将被拍照和打分。 用ｖ／指明３个品系的锥虫在孵育后是变蓝还 是无色。 ２． 品系Ｔ１ 品系Ｔ２ 品系Ｔ３ 蓝色 无色 任务２：周期蛋白前体的存在（８６分） ２．１ 如何使用计数池（１分） 你将使用计数池确定实验２．３和实验２．４的 锥虫的密度。２个可以独立使用的计数池被做在 一块载玻片上。请注意，这些计数池不能净化．也 不会提供给你多余的计数池。这些计数池不需要 盖玻片 按照以下步骤确定悬浮液中锥虫的密度： １）吸取１Ｏ Ｌ悬浮液放人计数池。 ２）至少等待２ ｍｉｎ，使细胞沉到底部。 ３）将载玻片放置于显微镜下，计数灰色阴影 所标明的４个大方格中３个格内每个里面的锥 虫数目。 ２０ｌ５年第５０卷第６期 生物学通报 ５７ ７）在一个新的小离心管中，准备１００ Ｌ ｌ：１０ ● ｌ ● ■ － 一 ｌ ・●… － …。的上清稀释液，用ＰＢＳＢ稀释。 ８）吸取３６ Ｌ的上述稀释液到另一个新的 ● （） ● ＩＩｌ 小离心管中，加入４ Ｌ固定液（ＦＢ）。上下吹吸 以混匀。 ９）按照２．１所示的步骤，计数锥虫的数目，将 结果填人下表。 １０）计算每一个方格内锥虫的平均数（精度： 保留置小数点后３位）。这些数据会在２．５用到。 Ｑ４ 品系Ｔ１ 方格ｌ 方格２ 方格３ 每格的平均数 品系Ｔ２ 品系Ｔ３ Ｉ －．… ●…；： （ ｍｍ ｌｎ１ｍ Ｉｍｍ 你可以用ｌ０倍物镜或４０倍物镜，建议按照 蛇形路线依次经过每个小格，以免失去方向。为防 止潜在的个人偏好性，只计数方格内及跨左侧或 底测边线的锥虫（黑圈所示），而不计数方格外、 横跨右侧或上侧边线的锥虫（白圈所示）。要从所 计数的锥虫数目得Ｈｊ锥虫的密度，首先确定含有 所计数的锥虫的悬浮液体积，填写在下表中。注 意计数池的高度恰好为０．１ ｍｉｌｌ，每个计数池的边 长恰为１ ｍｍ（见上图）。（１分） Ｑ３ 每个计数格的体积（ｍｍ’） 每个计数格的容积（ｍＬ） ２＿４总的锥虫密度（２５．５分） 为了确定原来的悬液中总的锥虫密度．品系 ＴＩ、Ｔ２和Ｔ３分别按下述步骤操作： １）在新的小离心管中准备１００ Ｌ ｌ：１０的原 始悬浮液的稀释液，用ＰＢＳＢ稀释。吸取之前上下 颠倒混匀锥虫悬液。 ２）吸取３６ Ｌ的上述稀释液到另一个新的 小离心管中，加入４ Ｌ固定液（ＦＢ）。上下吹吸 以混匀。 ２．２ 清洗磁珠 按下面步骤清洗磁珠２次： １）向管中加入１ ｍＬ冷的磷酸盐缓冲液 （ＰＢＳＢ）．上下吹吸混匀。 ２）将小离心管置于磁性管架上，至少等待 ｌ ｍｉｎ以使磁珠被拉下。 ３）将上清液吸去，弃入废液桶（ＬＷ）。最后，用 ３５ Ｌ ＰＢＳＢ缓冲液重新悬浮磁珠，并置于冰上。 ２．３不与磁珠结合的锥虫的密度（３７．５分） 按下述步骤，在锥虫品系Ｔ１、Ｔ２和Ｔ３的样品 ３）按照２．１所示的步骤，计数锥虫的数目，将 结果填入下表。 ４）计算每方格中锥虫数目的平均值和标准差 （精度：小数点后保留３位）。这些数据会在２．５用 到。 中分别拉下表达周期蛋白前体的锥虫： １）用移液器在一个新的空小离心管中加入 １９０ Ｌ锥虫悬液。在吸取悬液前，上下颠倒混匀。 ２）加入１０ Ｌ洗过的磁珠，吸取磁珠前要重 计算标准差的公式如下，１３是重复实验次数， 是每个实验的值， 是平均值。 厂———— —————一 新使其悬浮（重悬）起来。 ３）在冰上孵育３０ ｍｉｎ。每３—５ ｒａｉｎ要非常轻 柔地重悬磁珠．方法是颠倒离心管并用手指轻弹离 ｓＤ＝Ｖ ． （Ｘｉ一 Ｑ５ 品系Ｔｌ 品系Ｔ２ 品系Ｔ３ 心管。在孵育的时间内，可以进行实验２的其他工 作。４）用磁性管架将磁珠拉下。 ５）离心管仍在管架上的时候，吸取全部上清， 放人另一个新的小离心管，并置于冰上。 方格１ 方格２ 方格３ 每个方格的平均值 每个方格所得值的标准差 ６）立即用５０ Ｌ的ＰＢＳＢ非常轻柔地重悬磁 珠．置于冰上 ２．５ 成功删除周期蛋白前体基因的效率（９分） ５８ 生物学通报 ２０１５年第５Ｏ卷第６期 实验的最终目的是根据计数的平均值，计算 和比较不与磁珠结合的锥虫的密度及开始的悬液 中总的锥虫密度。但是，你首先必须计算平均值的 标准差（ＳＥ一）确定有几位有效数字。假设计数结 果呈正态分布，ＳＥ一的计算公式是 ： Ｖ ｒｌ 计算２．４中标准差最大的那个锥虫样品的 ＳＥ一，将结果填入下表（精度：小数点后３位）。 （０．６分） Ｑ６ ＳＥ一可以告诉你精确度，据此你可以估计每 格的锥虫平均数。根据这个估算，比较估算平均值 加ＳＥ一和估算平均值减ＳＥ一，以确定有效数字 的位数（所有的数位包括第１个你不能确定那位 数）。例如：如果平均值是１２３４．５６７，ＳＥ一是 ９８．７６５，你必须比较１２３４．５６７＋９８．７６５＝１３３３．３３２ 和１２３４．５６７—９８．７６５＝１１３５．８０２。在这种情况下，有 ２位有效数字，平均数应该是１．２×１０，。根据你的 结果，说明你应该用几位有效数字。（１．５分） ∞‘臣 ｆ有效数字的数目 ｌ工二 ｌ 用你上面所得出的有效数字数目，在下表中 填入每方格中锥虫的平均数（０．６分） Ｑ８ 品系Ｔｌ 品系Ｔ２ 品系Ｔ３ 每方格中不与磁珠结合的锥 虫数的平均值（来自２．３） 每方格中总的锥虫数的平均 值（来自２．４） 用这些数据，估计用于计数的稀释液中的锥 虫密度，填写在下表中。用相同的有效数字位数。 （３．７分） Ｑ９ 品系Ｔｌ 品系Ｔ２ 品系Ｔ３ 用于计数的每毫升稀释液中．不与 磁珠结合的锥虫数（来自２．３） 用于计数的每毫升稀释液中．总的 锥虫数（来自２．４） 最后，计算不与磁珠结合的锥虫密度，以及原 始悬液中总的锥虫密度．填写在下表中。用相同的 有效数字位数。（１．１分） Ｑ１０． 品系Ｔ１ 品系Ｔ２ 品系Ｔ３ 每毫升原始的锥虫悬液中，不与 磁珠结合的锥虫数（来自２．３） 每毫升原始的锥虫悬液中，总的 锥虫数（来自２．４） 为了评价基因删除实验的成功率。计算每个 品系中不与磁珠结合的锥虫所占百分比。用原始 悬液的密度估计值来计算，将结果写入下表（精 度：仅保留到整数百分数）（１．５分） Ｑ１１ 品系Ｔ１ 品系ｒＩ’２ 品系Ｔ３ 不与磁珠结合的锥虫所占百分比 ２．６与磁珠结合的确证（９分） 下面你将在显微镜下确证．在磁珠拉下后所 观察到的锥虫的减少，是否缘于锥虫与磁珠的结 合。要做到这一点，每一品系都要进行如下实验： １）从２．３中重悬的磁珠中吸取ｌ０ Ｌ，放在 载玻片上。 ２）在液滴上盖上盖玻片。 对结合于磁珠上的锥虫所占比例进行粗略估 计。要确定锥虫与磁珠结合，只要看磁珠摆动时锥 虫也随之移动即可。 对每个品系，在下表中用 表示哪个描述最 接近你的观察结果。（９分） Ｑ１２ 品系Ｔ１ 品系Ｔ２ 品系Ｔ３ 样品中几乎没有与磁珠结合的锥虫 样品中少于５Ｏ％的锥虫与磁珠结合 样品中多于５０％的锥虫与磁珠结合 ２．７描述你的结果（４分） 每个样品经过磁珠拉下的处理后．用ｖ／表示 最符合锥虫减少情况的描述。（３分） Ｑ１３ 品系Ｔ１ 品系Ｔ２ 品系Ｔ３ 减少．至少在某种程度上是由 于和磁珠结合 无变化，或仅是随机变化 用ｖ／标示基因缺失效率最高的品系。（１分） Ｑ１４． （待续） （Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｃｈｒ＠ｐｋｕ．ｄｅｕ．ｅｎ）