发酵实验报告

发酵工艺及设备实验报告

学院： 化学化工学院 专业：生物工程 班级：1201学号：************ 学生姓名： ** 日期 2014年11月

实验一 摇瓶发酵法制备糖化酶

一、实验目的

（1）掌握摇床发酵法制备糖化酶的工艺流程及操作方法 （2）了解利用黑曲霉菌菌种发酵时的生长条件及注意事项 （3）熟练掌握实验过程中的无菌操作和培养条件的选择

二、实验仪器及试剂

菌种：黑曲霉

仪器：锥形瓶（500ml)、移液管、恒温水浴锅、秒表、50mL比色管、牛皮纸、纱布（8层）、pH计。

药品：三水乙酸钠、冰醋酸、硫代硫酸钠、碘、氢氧化钠、硫酸、可溶性淀粉、玉米粉、豆饼粉、麸皮

三、实验原理

摇瓶发酵是实验室常用的通风发酵方法，通过将装有液体发酵培养基的摇瓶放在摇床上振荡培养，以满足微生物生长、繁殖及产生许多代谢产物对氧的需求。它是实验室筛选好气性菌种，以及摸索种子培养工艺与发酵工艺的常用方法。

葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3）系统名为淀粉α-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶，俗称糖化酶，是国内产量最大的酶品种。糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原末端切开α-1,4键，也能切开α-1,3键和α-1,6键，产生葡萄糖。

糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算酶活力。

四、实验步骤 1.培养步骤

1.1种子培养基制备及灭菌

将新鲜土豆去皮切块，称取200~300 g土豆块放入500 mL烧杯中，加入一定量水，在电炉上煮沸至土豆块熟透，用120目纱布过滤，滤渣反复用一定量水清洗、过滤2次，合并各次滤液且定容至1000 mL即得土豆汁。取一定体积的土豆汁，在其中加入5%的蔗糖，溶解摇匀并调pH至5.5，即得种子培养基。将适

量种子培养基倒入锥形瓶（250ml），用纱布塞塞住管口，并用牛皮纸包扎，置灭菌锅中，于121℃下灭菌30min。待灭菌完毕，冷却取出。

1.2发酵培养基制备及灭菌

取6只500mL摇瓶，分别按装液量100、200、300mL配制培养基（玉米粉6%、豆饼粉2%、麸皮1%），加水后稍微摇动，使原料湿润，浸入水中。用8层纱布包扎瓶口，再加牛皮纸包扎。置灭菌锅中，于121℃下灭菌30min。 1.3发酵培养基接种：将已生长好的菌种，在无菌条件下，按照10%的接 量（8%-12%）接种到发酵培养基上。

1.4发酵培养基发酵：将摇瓶固定在摇床上，培养温度为31℃，转速为120r/min，培养时间96h。显微镜观察菌丝形态，用试纸测发酵液pH，测定酶活力。摇瓶培养时观察各种摇瓶机的结构。

2.糖化酶活力测定

2.1待测酶液的制备：

精确吸取液体酶1.00mL，先用少量的乙酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中。沉渣部分再加入少量缓冲液，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（估计酶活力在100~250u/mL范围内），摇匀。通过4层纱布过滤，滤液供测定用。

2.2酶活力测定：

于甲、乙两支50mL比色管中，分别加入可溶性淀粉溶液25mL及缓冲液5mL，摇匀后，于40℃恒温水浴中预热5min。在甲管（样品）中加入待测酶液2mL，立刻摇匀，在此温度下准确反应30min，立刻各加入氢氧化钠溶液0.2mL，摇匀，将两管取出迅速冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2mL。吸取上述反应液与空白液各5mL，分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶液10mL，再加氢氧化钠溶液15mL，摇匀塞紧，于暗处反应15min。取出，加硫酸溶液2mL，立即用硫代硫酸钠标准液滴定，直至蓝色刚好消失为其终点。

2.3酶活力计算：

样品酶活力（u/g或u/mL）=579.9×(A-B)c×n式中：A与B分别为空白、样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL；c为硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L；n为稀释倍数。

五、数据分析

比较不同装液量下的菌体形态特征、酶活力，将结果填入下表：

装液量/mL

指标 酶活力 pH 菌体特征

100 420u/mL 4.2

200 510u/mL 4.1

300 570u/mL 3.8

出现球状的白色的菌丝团，瓶壁上出现黑丝的孢子和菌丝

六、 结论

1.不同的装液量对酶活力的影响是随着装液量的增加呈现上升的趋势，但是酶活力变化不大，并且酶活力不高，与其他组数据相比接种量跟酶活力关 2.菌体特征在锥形瓶的瓶壁上出现白色的菌丝，在培养基中也出现了丝球 3.菌种新陈代谢的旺盛二氧化碳的释放增加，使pH值逐渐下降，最终使培养基的pH下降至3.8左右。

实验二 酿酒酵母发酵过程参数的测定及计算

一、实验目的

1.测定并绘制生长曲线、底物消耗曲线和产物形成曲线

2.了解发酵过程中葡萄糖的利用、菌体生长和产物生成的相互关系 3.初步学会菌体生长、底物消耗和产物生成有关发酵参数的求解

二、实验仪器及试剂

菌种：酿酒酵母

仪器：锥形瓶（250ml）、移液管、pH计、生物传感仪、分析天平

药品：酵母膏、胰蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、苯甲酸钠、EDTA钠、氯化钠

三、实验原理

酵母菌是兼性厌氧型真菌，喜欢含糖的环境， 有氧时将葡萄糖分解成CO₂和水，无氧时将葡萄糖分解成酒精和二氧化碳，同时都释放出能量

生物传感器由生物识别元件和信号转换器组成，能够选择性地对样品中的待测物发出相应，通过生物识别系统和电化学或其他传感器把待测物质的浓度转为电信号，根据电信号的大小定量测出待测物质的浓度。生物传感器是应用生物活性材料（如酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等）与物理或化学换能器有机结合的一门交叉学科，是发展生物技术必不可少的一种先进的检测方法与监控方法，也是物质在分子水平的快速、微量分析方法

四、 实验步骤

1.种子培养基（YEPD，g/L）：称取酵母膏10g、胰蛋白胨20g、葡萄糖20g，加蒸馏水溶解，调节pH 5.0左右，并定容至1000ml。

2.发酵培养基（g/L）：称取酵母膏10g，胰蛋白胨20g，葡萄糖100g加蒸馏水溶解，调节pH 至5.0左右，定容至1000ml，分装10个锥形瓶（250ml）封口121℃，30min灭菌。

3.种子培养：将活化好的种子培养液，用移液管移去10ml接种于灭菌YEPD液体培养基中， 于30℃、120 r/min全温摇瓶柜中培养24 h左右，观察种子液的色泽、气味与形态等基本情况。

4.发酵方法：将培养好的种子液按8-12%的接种比例，接种于发酵培养基中，置于30 ℃、120 r/min全温摇瓶柜中培养96 h。

5.过程取样：发酵培养基接种发酵后，每隔8小时取样，移取45ml菌液至离心试管中3800r/min离心，上清液取出分析，菌泥放置烘箱烘干，分析菌体生物量、残余葡萄糖浓度与酒精生成量，并以此为基础数据计算参数

6.生物量的测定：取等量的两份发酵液，一份由烘干法测得菌体干重（DCW），另一份稀释成一定的浓度于630 nm下测定吸光值（OD值），得到标准曲线为DCW=3.87×OD（R=0.996）。再以相同方法测得样品的OD值，按标准曲线计算出菌体干重。

7.还原糖的测定与乙醇的测定：使用生物传感仪测定糖类和酒精的含量

五、 数据分析

表1相关参数的计算

发酵参数 发酵周期 (h) 初始葡萄糖浓度 (g/L) 残余葡萄糖浓度 (g/L) 最大菌体干重 (g/L) 最大酒精浓度 (g/L) 平均比生长速率 (h-1) 平均比糖消耗速率 (h-1) 测定值或计算值 90 99.96 0.9 11.8 11.6 1203. 5.63 发酵参数 平均比酒精生成速率 (h-1) 葡萄糖消耗速率 [g/(L·h)] 酒精转化率 (%) 细胞转化率 (g/g) 酒精产率 [g/(L·h)] 细胞产率 [g/(L·h)] 测定值或计算值 3.25 1.1 7.03% 1.05 1..06 0.117

表2 残糖量-生物量

时间 h 残糖量g/100ml 生物量g/100ml 图1

0 9 18 2.0 27 1.1 36 0.5 45 0.5 54 0.20 63 0.13 72 0.1 81 90 9.96 5.5 0.08 0.09 0 0.76 0.88 0.84 1.02 1.14 1.06 1.14 1.18 1.16 1.18 葡萄糖-酒精含量随时间变化关系12108642002040时间（h）6080100葡萄糖酒精含量g/ml

图2

酒精含量随时间关系曲线酒精含量1.4酒精含量（g/ml)1.210.80.60.40.2002040时间（h）6080100

六、 结论

1.从酒精的产率上来说理论上是每100g葡萄糖所产酒精的含量是165.6g，但最大酒精含量只有12g左右，产率刚刚达7.03%，说明大多数的葡萄糖转化成菌种生长所需要的能量物质

2.出现误差的原因：在移取所含菌种的培养液时没有摇匀，导致所接种的每个锥形瓶中的生物量出现偏差，在测量其残糖含量、转化成酒精的含量受到较大的影响。

3.使用分光光度法测定生物量，由于所配置的培养基中含有葡萄糖，经高温杀菌后，转变成焦糖类物质，出现棕红色，对测吸光度时产生了较大影响，对实验造成了较大的误差。

实验三 酿酒酵母反复分批发酵制备酒精

一、实验目的

1.初步学会酿酒酵母反复分批发酵法生产酒精的工艺操作 2.了解反复分批发酵法工艺的优缺点

二、实验仪器及试剂

菌种：酿酒酵母

仪器：锥形瓶（250ml）、移液管、量筒、pH计、生物传感仪、分析天平 药品：酵母膏、胰蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、苯甲酸钠、EDTA钠、氯化钠

三、实验要求

1.对整个反复分批发酵过程的菌体生长、葡萄糖消耗和酒精生成作图； 2.计算每一个发酵过程的酒精浓度（或产量）、得率（或转化率）和产率（生产强度）

四、 实验步骤

1.种子培养基（YEPD，g/L）：称取酵母膏2.5g，胰蛋白胨5g，葡萄糖5g；于烧杯中，加蒸馏水溶解，调节pH至5.0左右，定容至250ml。121℃、30min灭菌处理。

2.发酵培养基（g/L）：称取酵母膏5g，胰蛋白胨10g，葡萄糖50g于烧杯中，加蒸馏水溶解，调节pH至5.0左右，定容至500ml，分装入250ml的锥形瓶中，封口，置于灭菌锅121℃.30min灭菌。

3.种子培养：将活化的种子液移取10ml接种于灭菌YEPD液体培养基中， 于30℃、120 r/min全温摇瓶柜中培养20 h左右，观察种子液的色泽、气味与形态等基本情况。

4.发酵方法：将培养好的种子液按10%的比例接种于发酵培养基中，置于30 ℃、120 r/min全温摇瓶柜中培养24 h。

5.反复分批操作：当第一个分批发酵完成后，在无菌操作条件下，将发酵部分或全部倒入灭过菌的50mL离心管中，45ml。量取，旋紧盖子密封后离心，再在无菌操作条件用无菌水洗涤，如此循环1~2次后，倒入少量新鲜培养基将菌株充分悬浮，重新倒回原新鲜培养基三角瓶后扎紧纱布，置全温摇瓶柜中于发酵条

件下培养。如此循环操作，直到菌株衰退为止。

6.过程取样：每批发酵培养基接种发酵后，每隔几小时取样分析菌体生物量、残余葡萄糖浓度与酒精生成量，并以此为基础数据进一步完成实验要求的内容

五、 数据分析

表1 分批发酵实验数据

时间（h） pH值 生物量（g/100ml） 残余葡萄糖(g/100ml) 酒精生成量（g/100ml） 图1

pH值随时间变化关系5.1512 4.70 0.41 4.7 24 4.63 0.52 4.4 36 4.65 0.52 4.5 0.05 0.066 0.06 pH值4.9pH值4.84.74.605101520时间（h）25303540

图2

葡萄糖含量随时间变化关系12葡萄糖含量（g/ml）108642005101520时间（h）25303540葡萄糖含量

图3

酒精生成量随时间变化关系0.07酒精含量酒精量（g/100ml）0.060.050.040.030.020.01005101520时间25303540

实验心得

在本次实验中，我们从拿到实验题目到完成全部的实验，可以说遇到了很

多的困难，但最后还是在和同学的商讨中找到了解决的方案。从这次实验中我收获了很多，也加深了对发酵理论知识的一次巩固，下面是我在这次实验中的总结

由于时间段，所以我们三个实验同时开始的，所以说工作量有点大，从配制培养基到灭菌接种，然后培养，再到从其中的取样分析的过程。在培养基的配制过程中我们采取了不同装液量，探究不同的装液量对酒精的生成以及其他的含量组成的变化，因为发酵的时间比较长，所以我们计划在实验二的发酵阶段开始完成对实验一的一些数据的测试。实验一我们通过分别做静置培养与摇床的搅拌发酵，从结果中可以看出搅拌对发酵是有利的，生物量，酒精的生成量都高于静置发酵。在实验二中我们在生物量测定的过程中遇到的问题比较多，由于我们所用的葡萄糖在高温下焦糖化，使培养基的颜色变深，这样在后面测定生物量的时候，就会出现吸光度测定不准确，造成实验误差。当我们把发酵液稀释的倍数变得很大，造成发酵液里的生物量变得很少也会造成较大的实验偏差。在实验三中，每次转移的的时候，都为无菌操作，但是有的组就出现了有其他的杂菌的生长的现象，而且杂菌生长的比较茂盛（定置发酵，容易观察），所以在以后的发酵或

者其他无菌实验中一定注意无菌操作的重要性，加强自己在实验中操作的规范性。同时在本次试验中，我也体会到了团队合作的重要性，我们这组中有四个同学，各司其职，保证了实验的顺利进行。还有遇到问题和其他组的交流的过程，让我学到了很多的东西。

最后，通过这次的发酵实验我不但对理论知识有了更加深的理解，对于实际的操作和也有了质的飞跃。经过这次的实验，我们整体对各个方面都得到了不少的提高。我们在做实验不要一成不变和墨守成规，应该有改良创新的精神。实际上，在弄懂了实验原理的基础上，做实验应该是游刃有余的，如果说创新对于我们来说是件难事，那改良总是有可能的，所以当一些同学问我接种量的时候我都会让他们自己定。还有以后的实验中要多思考，想好实验流程后，再动手避免不必要的浪费时间。

同组实验人员：

2014年11月29日