50×TAE Buffer (pH8.5)
组份浓度 2 M Tris-醋酸,100 mM EDTA 配制量 1 L
配制办法 1.称量下列试剂,置于1 L烧杯中.
Tris Na2EDTA·2H2O 242 g 37.2 g 2.向烧杯中参加约800 ml的去离子水,充分搅拌消融. 3.参加57.1 ml的乙酸,充分搅拌.
4.加去离子水将溶液定容至l L后,室温保管. 10×TBE Buffer (pH8.3)
组份浓度 890 mM Tris-硼酸,20 mM EDTA 配制量 1 L
配制办法 l.称量下列试剂,置于l L烧杯中.
Tris Na2EDTA·2H2O 硼酸 108 g 7.44 g 55 g 2.向烧杯中参加约800 ml的去离子水,充分搅拌消融. 3.加去离子水将溶液定容至l L后,室温保管. 10×MOPS(3-吗啉基丙磺酸)Buffer
组份浓度 200 rnM MOPS,20 mM NaOAc,10 mM EDTA 配制量 1 L
配制办法 1.称41.8 g MOPS,置于1 L烧杯中. 2.加约700 ml DEPC处理水,搅拌消融. 3.应用2 N NaOH调节pH值至7.0. 4.再向溶液中参加下列试剂.
1 M NaOAc(DEPC处理) 0.5 M EDTA(pH8.0)(DEPC处理) 20ml 20 ml 5.用DEPC处理水将溶液定容至1 L. 6.用0.45 m滤膜过滤除去杂质. 7.室温避光保管.
注：溶液见光或高温灭菌后会变黄.变黄时也可应用,但变黑时不要应用. 溴乙锭 (10 mg/ml)
组份浓度 10 mg/ml溴乙锭 配制量 100 ml
配制办法 1.称量1 g溴乙锭,参加到100 ml容器中.
2.参加去离子水100 ml,充分搅拌数h完整消融溴乙锭. 3.将溶液转移至棕色瓶中,室温避光保管. 4.溴乙锭的工作浓度为0.5 g/ml. 留意：溴乙锭是一种致癌物资,必须当心操纵. Agarose凝胶
配制办法 1.配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(平日是0.5×TBE或1×TAE).
2.根椐制胶量及凝胶浓度,精确称量琼脂糖粉,参加恰当的锥形瓶中.
3.参加必定量的电泳缓冲液(总液体量不宜超出锥形瓶的50%容量).
注：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须同一.
4.在锥形瓶的瓶封上保鲜膜,并在膜上扎些小孔,然后在微波炉中
加热融化琼脂糖.加热进程中,当溶液沸腾后,请戴上防热手套.当心动摇锥形瓶.使琼脂糖充分平均融化.此操纵反复数次,直至琼脂糖完整融化.必须留意,在微波炉中加热时光不宜过长,每次当溶液起泡沸腾时停滞加热,不然会引起溶液过热暴沸,造成琼脂糖凝胶浓度不准,也会破坏微波炉.融化琼脂糖时,必须包管琼脂糖充分完整融化,不然,会造成电泳图像隐约不清.
5.使溶液冷却至60℃阁下,如须要可在此时参加溴乙锭溶液(终
浓度0.5 µg/ml).并充分混匀.
注：溴乙锭是一种致癌物资.应用含有溴乙锭的溶液时,请戴好手套.
6.将琼脂糖溶液倒入制胶模中,然后在恰当地位处插上梳子.凝胶
厚度 一般在3~5 min之间.
7.在室温下使胶凝固(大约30 min~1 h),然后放置于电泳槽中进行电泳.
注：凝胶不立刻应用时,请用保鲜膜将凝胶包好后在4℃下保管,
一 般可保管2~5天.
琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辩规模
琼脂糖浓度 0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0% 最佳线形DNA分辩规模(bp) 1,000~30,000 800~12,000 500~10,000 400~7,000 200~3,000 50~2,000 6×Loading Buffer(DNA电泳用) 组份浓度
30 mM 36%(V/V) 0.05%(W/V) 0.05%(W/V) EDTA Glycerol Xylene Cyanol FF Bromophenol Blue 配制量 500 ml
配制办法 1.称量下列试剂,置于500 ml烧杯中. EDTA Bromophenol Blue Xylene Cyanol FF 250 mg 250 mg 2.向烧杯中参加约200 ml的去离子水后,加热搅拌充分消融. 3.参加180 ml的甘油(Glycerol)后,应用2 N NaOH调节pH值至7.0.
4.用去离子水定容至500 ml后,室温保管.
10 × Loadlng Buffer(RNA电泳用) 组份浓度
10 mM 50%(V/V) 0.25%(W/V) 0.25%(W/V) EDTA Glycerol Xylene Cyanol FF Bromophenol Blue 配制置 10 ml
配制办法 1.称量下列试剂,置于10 ml离心管中. 0.5 M EDTA(pH8.0) Bromophenol Blue Xylene Cyanol FF 200 µl 25 mg 25 mg 2.向离心管中参加约4 ml的DEPC处理水后,充分搅拌消融. 3.参加5 ml的甘油(Glycerol)后,充分混匀. 10 ml后,室温保管.
四.核酸.蛋白质杂交用相干试剂.缓冲液的配制办法
20×SSC
组份浓度 3.0 M NaCl,0.3 MNa3citrate·2H2O(柠檬酸钠) 配制量 1 L
配制办法 1.称量下列试剂,置于l L烧杯中. NaCl Na3citrate·2H2O 175.3 g 88.2 g 2.向烧杯中参加约800 ml的去离子水,充分搅拌消融.
3滴加14 N HCl,调节pH值至7.0后,加去离子水将溶液定容至1 L.
4.高温高压灭菌后,室温保管. 20×SSPE Buffer
组份浓度 3.0 M NaCl,0.2 M NaH2PO4,0.02 M EDTA 配制办法 1.称量下列试剂,置于l L烧杯中.
NaCl NaH2PO4·H2O Na2EDTA·2H2O 2.向烧杯中参加约800 ml的去离子水,充分搅拌消融. 3.加NaOH调节pH值至7.4(约6.5 ml的10 N NaOH). 4.加去离子水将溶液定容至l L. 5.高温高压灭菌后,室温保管. 50 X Denhardt’S溶液 组份浓度 1%(W/V) Ficoll 400(菲可400/水溶性聚蔗糖400) 配制量 500 ml
1%(W/V) Polyvinylpyrrolidone 配制办法 1.称量下列试剂,(聚维酮/聚乙烯吡咯烷酮) 置于500 ml烧杯中. 1%(W/V) BSA Flcoll 400 2.加去离子水约5 g 5 g 400 ml,充分PoLyvlnylpyrrolldone 搅拌消融 5 g BSA 3.加去离子水将溶液定容至500 ml.
4.用0.45µm滤膜过滤后,分装成每份25 ml. 5.-20℃保管. 0.5 M磷酸盐Buffer
组份浓度 0.5 M Na2HPO4. 配制量 l L
配制办法 1.称量134 g Na2HPO4·7H2O置于l L烧杯中. 2.参加约800 ml的去离子水充分搅拌消融.
3.参加85%的H3PO4(浓磷酸)调节溶液pH值至7.2. 4.加去离子水定容至1 L.
5.高温高压灭菌后,室温保管. Salmon DNA (鲑鱼精DNA)
组份浓度 10 mg/ml Salmon DNA 配制量 约100 ml
配制办法 1.称取鲑鱼精DNA 2 g置于500 ml烧杯中,参加约200 ml的TE Buffer.
2用磁力搅拌器室温搅拌2~4h,消融后参加4 ml的5 M NaCl,使
其终浓度为0.1 M.
3.用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次.
4.收受接管水相溶液后,应用17号皮下打针针头快速吸打溶液约
20次,以 割断DNA.
5.参加2倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀.
6.离心收受接管DNA后,消融于100 ml的去离子水中.测定溶液的OD260值.
7.盘算溶液的DNA浓度后,稀释DNA溶液至10 mg/ml. 8.煮沸10min后,分装成小份(1 ml/份).-20℃保管. 9.应用前在滚水浴中加热5min后,敏捷冰浴冷却. DNA变性缓冲液
组份浓度 1.5 M NaCl,0.5 M NaOH 配制量 1 L
配制办法 1.称量下列试剂,置于l L烧杯中.
NaCl NaOH 87.7 g 20 g 2.向烧杯中参加约800 ml的去离子水,充分搅拌消融. 3.加去离子水将溶液定容至l L后,室温保管. 预杂交液/杂交液(DNA杂交用) 组份浓度 6× SSC(或SSPE) 配制置 100 ml 5× Denhardt’s SDS 配制办法 1.0.5%(W/V) 称量下列试剂,Salmon DNA 置于200 ml100 µg/ml 烧杯中.
20×SSC(或SSPE) 50×Denhardt’s 10% SDS 10 mg/ml Salmon DNA 30 ml 10 ml 5 ml 1 ml 2.dH2O 用0.45µm滤膜滤去杂质后应用. 预杂交液/杂交液(RNA杂交用) 组份浓度 6× 配制量 5× 配制办法 1.0.5%(W/V) 置于200 ml100g/ml 54 ml 充分混匀后,应
2.
用0.45µm滤膜膜转移缓冲液用)
组份浓度 39 mM Tris,0.037%(W/V)SDS,20%(V/V)甲醇 配制量 1 L
配制办法 1.称量下列试剂,置于l L烧杯中. Glycine Tris SDS 2.9 g 5.8 g 0.37 g 50%(V/V) 20×SSC(或SSPE) 50×Denhardt’s 10% SDS 10 mg/ml Salmon DNA Formamide(甲酰胺) dH2O SSC(或SSPE) Denhardt‘s SDS Salmon DNA Formamlde 30 ml 10 ml 5 ml 1 ml 50 ml 4 ml 100 mL
称量下列试剂,烧杯中.
充分混匀后,应滤去杂质后应用. (Western杂交mM Glycine,48
2.向烧杯中参加约600 ml的去离子水,充分搅拌消融.
3.加去离子水将溶液定溶至800 ml后,参加200 ml的甲醇. 4.室温保管.
TBST Buffer(Western杂交膜清洗液)
组份浓度 20 mM Tris-HCl,150 mM NaCl,0.05%(V/V)Tween 20 配制量 1 L
配制办法 1.称量下列试剂,置于l L烧杯中. NaCl 1 M Tris-HCl(pH8.0) 8.8 g 20 ml 2.向烧杯中参加约800 ml的去离子水,充分搅拌消融. .5 ml Tween 20后充分混匀.
4.加去离子水将溶液定容至l L后,4℃保管. 关闭缓冲液(Western杂交用)
组份浓度 5%(W/V)脱脂奶粉/TBST Buffer 配制量 100 ml
配制办法 1.称5 g脱脂奶粉参加到100 mlTBST Buffer中,充分搅拌消融. 2.4℃保管待用(本关闭液应当现配现用).
五.试验室经常应用造就基的配制办法
Ampicillin(氨卡青霉素)(100 mg/ml) 组份浓度 100 mg/ml Ampicillin 配制量 50 ml
配制办法 1.称量5 g Ampicillin置于50 ml离心管中.
2.参加40 ml灭菌水,充分混杂消融后,定容至50 ml. 3.用0.22 µm过滤膜过滤除菌.
4.小份分装(1 ml/份)后,-20℃保管. IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(24 mg/ml) 组份浓度 24 mg/mL IPTG 配制量 50 mL
配制办法 1.称1.2 g IPTG置于50 ml离心管中.
2.参加40 ml灭菌水,充分混杂消融后,定容至50 ml. 3.用0 22 µm过滤膜过滤除菌.
4小份分装(1 ml,份)后,-20℃保管. X-Gal (20 mg/ml)
组份浓度 20 mg/ml X-Gal 配制量 50 ml
配制办法 1.称量l g X-Gal置于50 ml离心管中.
2.参加40 ml DMF(二甲基甲酰胺),充分混杂消融后,定容至50 ml.
3.小份分装(1 ml/份)后,-20℃避光保管. LB造就基
组份浓度 1%(W/V)Tryptone(胰蛋白胨),0.5%(W/V)Yeast Extract(酵母提
取物),1%(W/V)NaCl
配制量 1 L
配制办法 1.称取下列试剂,置于l L烧杯中. Tryptone Yeast Extract NaCl 10 g 5 g 10 g 2.参加约800 ml的去离子水,充分搅拌消融. 3.滴加5 N NaOH(约0.2 m1),调节pH值至7.0. 4.加去离子水将造就基定容至1 L. 5高温高压灭菌后,4.C保管. LB/Amp造就基 组份浓度
1%(W/V) 0.5%(W/V) 1%(W/V) 0.1 mg/ml Tryptone Yeast Extract NaCl Ampicillin 配制量 1 L
配制办法 1.称取下列试剂,置于l L烧杯中. Tryptone Yeast Extract NaCl 10 g 5 g 10 g 2.参加约800 ml的去离子水,充分搅拌消融. 3.滴加5 N NaOH(约0.2 mL).调节pH值至7.0. 4.加去离子水将造就基定容至1 L. 5.高温高压灭菌后,冷却至室温.
6.参加1 ml Ampicillin(100 mg/ml)后平均混杂. 7.4℃保管.
TB造就基 组份浓度 1.2%(W/V) Tryptone Yeast Extract 配制办法 1.2.4%(W/V) 配制磷酸盐缓;Glycerol 中液(0.17 M 0.4%(V/V) KH2PO4,0.72 M
17mM KH2PO4 K2HPO4)100 ml. 72mM K2HPOa 消融2.31 g
KH2PO4和l2.54 g K2HPO4于90 ml的去离子水中,搅拌消融 后,加去离子水定容至100 ml,高温高压灭菌.
2.称取下列试剂,置于l L烧杯中. Tryptone Yeast Extract Glycerol 12 g 24 g 4 m 3.参加约800 ml的去离子水,充分搅拌消融.
4.加去离子水将造就基定容至1 L后,高温高压灭菌.
5.待溶液冷却至60℃以下时,;参加100 ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液.
6.4℃保管.
TB/Amp造就基 组份浓度
1.2%(W/V) 2.4%(W/V) 0.4%(V/V) 17 mM 72 mM 0.1 mg/ml Tryptone Yeast Extract Glycerol KH2PO4 K2HPO4 Ampicillin 配制量 1 L
配制办法 1.配制磷酸盐缓冲液(0.17 M KH2PO4,0.72 M K2HPO4)100 ml.
消融2.31 g KH2PO4,和12.54g K2HPO4于90 ml的去离子水中,
搅拌消融后,加去离子水定容至100 ml,高温高压灭菌.
2.称取下列试剂,置于l L烧杯中.
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