技经济市场 毛细管电泳电致化学发光检测器的研制 苏孙煌 （闽江学院化学与化学工程系，福建福州３５０１０８） 摘要：本论文着眼于将国际先进的化学分离手段——毛细管电泳分离法和高灵敏的分析手段——电致化学发光检测法 相结合，研制“毛细管电泳——电致化学发光检测器”，并对其电化学、电致化学发光、分离检测等性能进行表征。本检测器 具有良好的电化学响应、电致化学发光响应，并初步用于Ｌｕｍｉｎｏｌ发光体系的毛细管电泳电致化学发光检测，结果表明该 检测器具有检测灵敏高、重现性好的优点，可应用于生命物质，如：ＤＮＡ、蛋白质、氨基酸、多肽物质的分离检测。 关键词：毛细管电泳；电致化学发光；检测器 ０绪论 除去电极表面残留的氧化铝。 高效毛细管电泳（ＨＰＥＣ）是近３Ｏ年发展起来的崭新的、先 １．３．２毛细管的处理 进的分离技术，其原理是根据被分离物质荷质比的不同，在高压 （１）１．０ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ清洗２ｈ，石英亚沸蒸馏水清洗５－０ｍｉｎ； 电场作用下，各组分在毛细管内以不同的迁移速度，从毛细管的 （２）０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣ１清洗０．５ｈ，石英亚沸蒸馏水清洗５－１０ｍｉｎ；（３） 一端流向另一端，依次到达检测器被检出。迄今为止，常见的与 ０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ清洗０．５ｈ，石英亚沸蒸馏水清洗５－１０ｍｉｎ。 ＨＰＣＥ联用的检测器有：紫外可见吸收、光激发荧光、质谱、安培 １．３．３高效毛细电泳一电致化学发光检测系统的研制 检等检测器，其中前三种检测器已经商品化。在这些检测器中紫 １）毛细管电泳一电致化学发光检测系统的基本构造 外可见检测器的通用性好，但灵敏度低；光激发荧光检测器中的 整个检测系统主要由以下各部分级成：（１）高压电源（ＨＶ）； 激光诱导荧光检测器和质谱检测器灵敏度高，但是仪器非常昂 （２）高压屏蔽箱；（３）暗箱；（４）微光测量系统；（５）恒电压系统； 贵；安培检测器由于其灵敏度高，仪器简单、价廉，在近年来得到 （６）记录装置。 较大的发展并有商品化的趋势，但通用性较差，在应用范围方面 ２）毛细管电泳一电致化学发光检测池的设计及加工 受到一定的限制。近年来发展起来的电致化学发光分析法的检 检测池由三部分组成：检测池的主体部分、工作电极部分、 测灵敏度可以与激光诱导荧光相媲美，．因此国内外分析工作者 检测池薄层隔膜（Ｔｅｌｆｏｎ薄膜）。 开始把目标瞄准高效毛细管电泳一电致化学发检测器 （１）检测池主体部分加工 （ＨＰＣＥ—ＥＣＬ）这一分离效率高、灵敏度高而开发成本低的检测 采用厚度约为ｌｃｍ的有机玻璃块（长和宽都应大于２．５ｃｍ， 器的研制及应用上面。本论文正是在这种背景下，进行毛细管电 以便于整个ＥＣＬ流动池的固定），在其中间部分依次加工。 泳一电致化学发光检测器的研制，并对其电化学、电致化学发 ①毛细管进样口（直径ｄ＝０．４ｍｍ），并用“环氧树脂”固定毛 光、分离检测等性能进行表征。 细管，作为整个流动池的进口。 １ 实验部分 ②多空玻璃塞接口（直径ｄ＝３．７ｍｍ），用“环氧树脂”固定。在 １．１实验仪器 有机玻璃块的顶部安装接地电极，并与多空玻璃塞相连，从而达 （１）＋３０ＫＶ／Ｏ．３ｍＡ高压电源（上海原子核研究所） 到整个“ＥＣＬ流动池”接地的效果。 （２）ＭＰ一１型溶出分析仪（山东电讯七厂） ③发光试剂进样口（直径ｄ＝０．４ｍｍ），在有机玻璃块中上部 （３）ＧＤ一１型微光测量仪（西安瑞科电子设备有限公司） 加工，高于其它孔约０．５ｃｍ； （４）ＨＷ色谱工作站（南京千谱构件有限公司） ④出口（直径ｄ＝０．４ｍｍ），嵌入不锈钢管（孔径较大的注射器 （５）ＬＫ９８微机电化学分析系统（天津兰力科有限公司） 针头），兼作辅助电极。 １．２实验试剂样品 ＠Ａｇ／ＡｇＣ１参比电极Ｅｌ（直径ｄ＝５．０ｍｍ），并与出口相连。 所用的Ｌｕｍｉｎｏｌ是由美国Ａｌｄｒｉｃｈ化学股份有限公司生产 由于检测池的主体部分为有机玻璃块，它对可见光有较好 的，其它实验药品均为分析纯级药品。 的透过性能，用它作为透光材料完全能满足应用较广的电致化 １．３实验方法 学发光体系，包括：鲁米诺、联吡啶钌电致化学发光体系的测量 １．３．１工作电极的处理 要求，因为它们的发光波长都在可见区。因此我们在检测池的主 Ｐｔ圆盘工作电极用０．３的氧化铝进行刨光，用石英蒸馏亚 体部分的中心位置空出直径ｄ＞３．０ｍｍ的空间作为透光窗。 沸水冲洗电极表面，并将电极置于石英蒸馏亚沸水中，用超声波 （２）工作电极设计及加工 工作电极为铂圆盘电极，电极的外套为一平整的Ｔｅｌｆｏｎ块， ２０１１年第１１期 经济市场 在其中一个对角的位置钻两个孔洞，可通过螺栓与检测池的主 体部分相连。 检测（见图３），以初步评价我们所研制的高效毛细管一电致化 学发光分离检测系统的性能。实验条件如下：１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌｕｍｉｎｏｌ， 缓冲液为０．０２ｍｏｌ／Ｌ，ｐｉｌｌ２的磷酸盐，进样电压为１ ８ＫＶ、进样时 （３）电致化学发光检测池的薄膜的设计及Ｄｎ＿Ｔ￣ 选用Ｔｅｌｆｏｎ薄膜，取２．５ｅｍ×２．５ｅｍ大小，厚度约为５０ ｍ， 其中间挖去一细长形部分，长约为１．５ｅｍ，宽约为０．１ｍｍ，使得薄 层池的体积约为３．５×１０—２ Ｌ。 （４）细管电泳电致化学发光检测池的组装 通过检测池的三部分：检测池主体、工作电极以及检测池薄 膜它们上面的螺栓口，用螺栓固定组装成电致化学发光检测池。 ２实验结果与讨论 ２．１ 高效毛细电泳一电致化学发光检测系统性能的表征 ２．１．１电致化学发光检测池的电化学性能的表征 用１×１０ ｍｏｌ／Ｌ Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］一ｌｍｏｌ／Ｌ ＫＣ１溶液作循环伏安 法测量以考察毛细管电泳一电致化学发光检测池的“三电极系 统”电化学性能，结果如图１所示。所得到的循环伏安曲线的氧 化峰电流（ｉｐ ）和还原峰电流（ｉｐ ）的比值接近１，相应的氧化还 原峰电位差值（Ｅ。）为８９ｍＶ，表明Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］在毛细管电泳一 电致化学发光薄层检测池中的电化学氧化还原过程基本上是可 逆的，即表明毛细管电泳一电致化学发光薄层检测池的三电极 系统正常。 Ｅ／Ｖ（Ａｇ／ＡｇＣ１） 图１ Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６１在毛细管电泳一电致化学发光流动池 中的循环伏安曲线 实验条件：Ｋ ｒｅ（ＣＮ）ｄ浓度为１ｍｍｏＩ／Ｌ，介质为ｌｍｏｌ／Ｌ ＫＣＩ，工作电极为 铂圆盘电极。扫速为２００ｍＶ／ｓ ２．１．２检测池的电致化学发光性能的表征 从检测池的“发光试剂进样口”加入Ｌｕｍｉｎｏｌ溶液（１×１０ ｍｏｌ／Ｌ的Ｌｕｍｉｎｏｌ—ｐｉｌｌ２磷酸盐缓冲液），考察其在自制的毛细管 电泳一电致化学发光检测池上的注动注射电致化学发光响应情 况，结果如图２所示。由图可以看出该ＥＣＬ检测池有较高的灵 敏度，并且流动注射发光峰很窄，表明这种检测池的死体积很小 可与高效毛细管电泳分离系统相匹配。 ２．１．３高效毛细电泳一电致化学发光分离检测系统性能的表征 我们在表征了电致化学发光检测器的性能之后，进一步将 高效毛细管电泳分离系统与电致化学发光检测器偶合组成一个 高效毛细管一电致化学发光分离检测系统（ＣＰＥ—ＥＣＬ）。接下来， 我们用该ＣＰＥ—ＥＣＬ系统对经典的发光试剂Ｌｕｍｉｎｏｌ对行分离 ２０１１年第１１期 间为１５ｓ，分离电压为２０ＫＶ。 ２００ １５０ —暑 差１００ ５Ｏ ０ Ｏ ｌ ２ ３ ４ ５ 时间Ｌ １ｎ Ｊ 图２ Ｌｕｍｉｎｏｌ在毛细管电泳一电致化学发光流动池中 的流动注射电致化学发光响应 实验条件：Ｌｕｍｉｎｏｌ浓度为１×１０ ｍｏｌ／Ｌ；栽液为ｐｉｌｌ２磷酸盐；流速为 １．０ｍＬ／ｍｉｎ；－Ｔ－作电极电位为８００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣ１） ㈣ ㈣湖 ㈣ Ⅲ。 ＾ ＇ 目 鬃 越 ８ ８ ５ ９ ９，５ １０ １０ １１ ｌ１ ５ １ ２ 时间（ⅢｉＩｒ１） 图３ Ｌｕｍｉｎｏｌ的毛细管电泳～电致化学发光分离检测谱图 实验条件：Ｌｕｍｉｎｏｌ浓度为１×１０ ｔｏｏｌ／Ｌ；缓冲介质：Ｏ．０２ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ１２．０ 磷酸盐；工作电极电位为８００ｍＶ 实验结果显示（如图３所示）在施加分离电压之后大约１０ 分钟时获得一个很灵敏的、峰形尖锐的Ｌｕｍｉｎｏｌ电致化学发光 峰。这表明我们所研制的ＣＰＥ—ＥＣＬ检测器具有死体积小、灵敏 度高良好性能。 ２－２结论 高效毛细管电泳一电致化学发光检测器性能的表征实验结 果表明：本检测器具有良好的电化学响应、电致化学发光响应； 将所研制的检测器与高效毛细管连用，用经典的电致化学发光 体系Ｌｕｍｉｎｏｌ－ＮａＯＨ为分离检测对象，对检测器的分离效率、 检测灵敏度进行评价，结果表明该检测器具有检测灵敏度高、重 现性好等优点。因此，本检测器可进一步应用于微量离子，和生 命物质如ＤＮＡ、氨基酸、多肽、蛋白质等的分离检测。 参考文献： 【１】邓延倬，金兰．高效毛细管电泳．科学出版社，２０００． ［２】Ｇａｒｒｅｔｔ Ａ．Ｆｏｒｂｅｓ，Ｔｉｍｏｔｈｙ Ａ．Ｎｉｅｌｎａｎ，Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｖ．Ｓｗｅｅｄｌｅｒ Ａｎａ１．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ，３４７（３）（１９９７）：２８９—２９３． ＠