姬松茸多糖对体外高糖培养乳鼠心肌细胞保护作用

２０１１（６）　龟闽苗　姬松茸多糖对体外高糖培养乳鼠心肌细胞保护作用　杨旭东　张　杰　王春涛　（黑龙江省牡丹江医学院，黑龙江牡丹江１５７０１１）　摘要　目的：探讨姬松茸多糖（Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｌａｚｅｉＭｕｒｉｌｌ　Ｐｏｌｙｓａｃ—　实验室提供。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｓｉｇｍａ公司），ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒（大连宝生　物有限公司）；荧光显微镜（奥林巴斯）。　１．２试验方法　１－２＿１　细胞培养与分组取乳鼠心脏，用Ｄ—Ｈａｎｋｓ洗涤３　ｃｈａｒｉｄｅｓ，ＡＢＰＳ）对体外高糖培养乳鼠心肌细胞凋亡的抑制作用　及其机制。方法：将Ｗｉｓｔａｒ乳鼠原代细胞随机分为５组，Ａ：空白　对照组；Ｂ：高糖组；Ｃ：Ｏ．４ｍｇ／ｍＬＡＢＰＳ组；Ｄ：０．８ｍｇ／ｍＬＡＢＰＳ　组。用荧光显微镜测定各组细胞凋亡情况，ＲＴ—ＰＣＲ法检测ｂｃｌ－　２、ｃａｓｐａｓｅ一３基因表达量的变化。结果：经ＡＢＰＳ干预后，凋亡细　次，剪成碎片，加入０．２５％胰蛋白酶消化细胞５　ａｉｒｎ后，接种　于１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液，３７℃、５％ＣＯ２孵箱中培　养。实验组：０．４、０．８　ｍｇ／ｍＬ的ＡＢＰＳ溶液，葡萄糖浓度为　２５　ｍｍｏｌ／Ｌ，正常对照组：正常培养心肌细胞，高糖组：葡萄糖　浓度为２５　ｍｍｏ￣Ｌ。　胞明显减少，ｂｃｌ一２表达增加，ｃａｓｐａｓｅ－３表达减少。结论：ＡＢＰＳ　抑制体外高糖培养的乳鼠心肌的凋亡，其机制可能与抑制Ｃ８Ｓ—　ｐａｓｅ一３、激活ｂｃｌ一２表达有关。　关键词　姬松茸多糖细胞凋亡ｂｃｌ一２　ｃａｓｐａｓｅ一３　文章编号　１０００～８３５７（２０１１）０６－００６５－０２　１．２．２　ＭＴＴ实验测定各组心肌细胞生长及增殖活性　各组　细胞加５　ｇ／Ｌ四甲基唑氮蓝（ＭＴｒ）２０　ｔｒＬ孵育；４　ｈ后，弃上　姬松茸为蘑菇科蘑菇属真菌，多糖为其主要成分，具有增　强机体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、降血糖等作用…嘲。抗肿瘤方　面的药用价值研究较多，关于其治疗糖尿病的研究较少。试验　以体外模拟糖尿病时体内高糖环境，研究ＡＢＰＳ对高糖环境　的心肌细胞的保护作用。　清，加入ＤＭＳ０ｌ５０　Ｌ，完全显色后，采用酶标仪测定各孔　４９０ｎｍ处吸光度（ＯＤ）值。按下列公式计算细胞生长抑制率　（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ，ＩＲ）。ＩＲ＝（对照组ＯＤ一实验组ｏｎ）／（对照组　ＯＤ一空白组０Ｄ）×ｌｏｏ％。　ｌ－２．３　细胞凋亡检测　给药４８　ｈ后，用胰酶消化细胞，冷　ＰＢＳ（ｐＨ　７．２）洗３遍，固定液４℃固定，１０　ｍｉｎ后弃固定液，蒸　馏水洗３遍，室温干燥，用５　ｍｇ／Ｌ　Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色１５　ａｉｒｎ，　置于荧光显微镜上观察细胞形态并计算细胞凋亡率。　１材料与方法　１．１　供试材料　１．１．１　实验动物　Ｗｉｓｔａｒ乳鼠雌雄各半，出生２～３　ｄ，由哈尔　滨医科大学实验动物中心提供。　菌　与１．　１．２　药物、试剂与仪器　ＡＢＰＳ溶液由牡丹江医学院中心　健　１．２．４　ＲＴ—ＰＣＲｃＤＮＡ。　检测ｂｃｌ一２、ｃａｓｐａｓｅ一３　ｍＲＮＡ表达：参考　Ｔｒｏｚｏｌ试剂盒提取细胞总ＲＮＡ，按ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒操作提取　康　反应条件：９４℃２　ｍｉｎ，９４℃３０　Ｓ，５０－６０℃３０　Ｓ，７２℃　１　ａｉｒｎ，３５次循环。取５　ＬＰＣＲ产物，加ｌ　Ｌ上样缓冲液，上　样后电压９０　Ｖ，电泳２　ｈ，ＤＬ２　０００为Ｍａｋｅｒ，结果用凝胶成像　细胞存活率降ｆ氐，经ＡＢＰＳ干预后心肌细胞存活率明显增高，　差异有显著意义（Ｐ＜Ｏ．０１）；高糖环境中，心肌细胞凋亡率增　高，经ＡＢＰＳ干预后心肌细胞凋亡率明显降低，差异有显著意　义（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１），见表１，图ｌ、２。　表１　各组心肌细胞存活率（　±ｓ，％）　系统扫描，测定光密度值并计算ｂｃｌ－２、ｃａｓｐａｓｅ一３／１８－ａｃｔｉｎ的　灰度值。　１．２．５统计学分析实验数据以（Ｘ￣Ｓ）表示，统计学处理采用　ＳＰＳＳ　ｌ１．５软件，多组间数据比较采用方差分析，两组间比较　采用ｔ检验。　２试验结果　２．１　各组心肌细胞增殖抑制率及凋亡率高糖环境中，心肌　注：与对照组比较，　Ｐ＜０．Ｏ１；与高糖组比较，＃Ｐ＜Ｏ．叭　收稿日期：２０１１＂－０５一ｌ３一稿；２０１１－０７—１５修改稿。　基金项目：治疗胰岛素抵抗中草药筛选评价系统的建立及新药　寻找（１１５１１４２７）　２．２各组心肌细胞ｂｃｌ－２和ｃａｓｐａｓｅ一３基因表达情况不　同浓度ＡＢＰＳ作用４８　ｈ后，与高糖组相比，随着药物浓度的　提高，细胞中ｃａｓｐａｓｅ－３基因表达逐渐降低，ｂｃｌ一２基因表达　６５　ｅ—ｍａｉｌ：ｘｉｎｇｚｈｅｏｌｍｄｊ＠１２６．ｃｏｒｎ　食用菌与健康　熟　撕　“　《　∞　在国苗　２０１１（６）　图１　０．８　ｍｇ／ｍＬＡＢＰＳ组细胞凋亡情况　图２高糖组细胞凋亡情况　逐渐增加。见表２。　表２　ＡＢＰＳ对心肌细胞ｂｃｌ－２和ｃａｓｐａｓｅ－３表达影响（瞄，ｍｇ，ｍＬ）　显降低ｃａｓｐａｓｅ一３基因ｍＲＮＡ表达，上调ｂｃｌ一２基因ｍＲＮＡ　表达。据此结果，可以推断ＡＢＰＳ正因为降低ｃａｓｐａｓｅ一３基因　ｍＲＮＡ表达、上调ｂｃｌ－２基因ｍＲＮＡ表达实现了抑制心肌细　胞凋亡的作用，但在实验动物体内是否具有上述作用等问题　还有待于进一步证实。露　参考文献　注：与对照组比较，　Ｐ＜Ｏ．０ｌ；与高糖组比较，＃Ｐ＜０．０１　［１】ＭｉｚｕｎｏＭ　ｅｔ　ａ１．ＭｉｎａｔｏＫ，ＩｔｏＨ，ｅｔ　ａ１．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｏｆ　ｌｉｑｕｉｄ—ｃｕｌｔｕｒｅｄ　Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｌａｚｅｉ　Ｍｕｒｉｌｌ【Ｊ１．　３　讨　论　糖尿病心肌病是糖尿病严重并发症之一，细胞凋亡在糖　尿病心肌病中起关键作用，可导致心肌细胞丢失及心力衰竭。　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１９９９，４７（４）：　７０７—７１４．　［２］刘常金，谷文英．巴西蘑菇胞外多糖的分离及抗肿瘤活性研究叨．　食品与发酵工业，２００ｌ，２７（１１）：２７—２９．　［３］陆利霞，谷文英，丁霄霖．姬松茸多糖体外免疫及抗肿瘤作用初　细胞凋亡又称为程序性细胞死亡（Ｐｒｏｇｒａｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ，ＰＣＤ），　是在一种受基因调控的细胞主动死亡过程。细胞凋亡涉及多　基因，其中ｂｃｌ一２基因是一种凋亡抑制基因，位于１８ｑ２１，其编　步研究药【Ｊ］．药物生物技术，２００２，９（６）：３２６—３２９．　［４】Ｌａｌｉｅｒ　Ｌ，Ｃａｒｔｒｏｎ　ＰＦ，Ｊｕｉｎ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｂａｘ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，２００７，１２（５）：８８７－８９６．　［５］Ｈａｎ　ＨＳ，Ｐａｒｋ　ＹＭ，Ｈｗａｎｇ　ＴＳ．Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｃｌ一２，Ｂｃｌ—　码的蛋白只有与调节蛋白Ｂａｘ形成二聚体时才有活性，当　Ｂｃｌ一２／Ｂａｘ比率高时，Ｂｃｌ一２抑制细胞凋亡　。ｂｃｌ一２基因可以　稳定线粒体膜，抑制ｃａｓｐａｓｅ一３的激活，使细胞免于凋亡Ｉ５１－［６１。　ｃａｓｐａｓｅ一３是细胞凋亡信号转导通路中的ＩＣＥ蛋白酶家族的　成员，ｃａｓｐａｓｅ一３被凋亡信号启动后，才能转变为成熟的酶，并　ＸＬ　ａｎｄ　ｐ５３　ｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ…．Ｊ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ　Ｈｅｐａｔｏｌ，２００６　（２１）：１　１０８—１　１ｌ４．　［６】郭文娟，王爱英．凋亡抑制基因Ｂｃｌ—ｘＬ的研究进展ｌ　Ｊ１．世界华人　消化杂志，２００８，１６（２５）：２８７１—２８７６．　酶切其特异的底物，通过影响特定信号分子参与细胞凋亡。　ｃａｓｐａｓｅ一３的活化是ＤＮＡ片段化及染色质凝聚等凋亡形态所　必需的　。　［７】闻春生，应斌武，张永刚，等．槲皮素对肺腺癌细胞株Ａ５４９细胞　中凋亡相关因子ｃａｓｐａｓｅ－３表达的影响【Ｊ］．中国肺癌杂志，　２００８，１１（２）：１９４—１９７．　结果显示：ＡＢＰＳ对体外高糖环境培养的心肌细胞具有　保护作用，可提高心肌细胞存活率，降低细胞凋亡率，并可明　●●●Ｉ　Ｉ４ｐ－●ＩＩ●ｈ●●●ｈ●●◆●Ｉ●●●●●１，１１●●ＩＩ●◆　Ｉ●［８】黄健，魏秀岩，孙博航，等．冬凌草甲素诱导ＨｅｐＧ２肝癌细胞凋亡　机制的研究【Ｊ］．中国现代中药，２　０１０，１２（１２）：２８—３２．　ｉｌ●●ＩＩ●ｎｈ●　●　ｉｈ●◆Ｉｈ◆　●ＩＩ●　（上接Ｐ５６）　参考文献　【１】边广．秀珍菇菇蚊菇蝇的消长规律及无公害防治技术研究【Ｄ】．　［Ｊ］．吉林农业大学学报，１９９８，２０（增刊）：１３２．　【６］陈祝安，黄基荣．不同来源绿僵菌对云斑金龟蛴螬致病力评价…．　微生物学通报，１９９７，２４（２）：８１—８３．　［７】张永军，王中康，殷幼平．球孢白僵菌的生物学特性及对小麦蚜　福建农林大学硕士学位论文，２００９．　【２】杨东霞，王升厚，衣杰，等．８种杀虫剂对食用菌菇蝇抑制作用的　研究Ⅲ．江苏农业科学，２００９（６）：１９２—１９４．　ｆ３　裘晖，吴振强，梁世中．金龟子绿僵菌及其杀虫机理ｌ３】Ｊ１．农药，　２００４，４３（８）：３４２—３４５．　虫的毒力ｆＪ１．西南农业大学学报，２００１，２３（２）：１４４—１４６．　【８】章玉苹，黄少华，李敦松，等．球孢白僵菌Ｂｅａｕｖｅｒｉａ　ｂａｓｓｉａｎａＢ６菌　株对桔小实蝇的控制作用【Ｉ１．中国生物防治，２０１０，２６（增刊）：　１４－１８．　【４】宋漳，景云，蔡和谦．应用绿僵菌防治马尾松毛虫初探ＩＪ］．福建林　学院学报，１９９７，１７（２）：１ｏ７—１０９．　【９］袁盛勇，孔琼，张宏瑞，等．蜡蚧轮枝菌对平菇厉眼蕈蚊幼虫和蛹　的毒力测定ＩＪ］．中国农学通报，２００９，２５（１９）：１９４—１９６．　【５１陈祝安，冯惠英，潘玲聪．不同来源绿僵菌对稻水象甲生物测定