钙调蛋白的N末端和C末端片段载体构建和蛋白制备

邵冬雪;孙嘉瑶;杜逸;李墨;唐子鉴;于佳慧;胡慧媛;孙雪菲;孙胜男

【摘 要】目的 构建钙调蛋白(CaM)的N末端片段(N-lobe)、C末端片段(C-lobe)及其钙离子(Ca2+)结合位点突变体(N-lobe12,C-lobe34)原核表达载体并进行蛋白表达、纯化和活性鉴定.方法 将上述cDNA片段插入PGEX-6p-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达.利用Glutathione-Sepharose 4B beads进行分离纯化.采用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量,Bradfo rd方法测定纯化后蛋白浓度,GST pull-down方法和膜片钳技术检测纯化后蛋白活性.结果 蛋白高表达,纯化后获得高纯度、高浓度目的蛋白,纯化后蛋白能与Cav l.2型钙通道结合并可恢复已“rundown”心肌细胞膜钙通道的活性.结论本研究成功构建可以表达生物活性蛋白的N-lobe、C-lobe、N-lobe12及C-lobe34原核表达载体,为深入研究CaM的生物学功能奠定了基础. 【期刊名称】《中国医科大学学报》 【年(卷),期】2016(045)010 【总页数】6页(P877-882)

【关键词】钙调蛋白;N末端片段;C末端片段;突变体;pull-down;膜片钳 【作 者】邵冬雪;孙嘉瑶;杜逸;李墨;唐子鉴;于佳慧;胡慧媛;孙雪菲;孙胜男

【作者单位】中国医科大学药学院药物毒理教研室,沈阳110122;中国医科大学药学院药物毒理教研室,沈阳110122;中国医科大学药学院药物毒理教研室,沈阳110122;中国医科大学药学院药物毒理教研室,沈阳110122;中国医科大学药学院药物毒理教研室,沈阳110122;中国医科大学药学院药物毒理教研室,沈阳110122;

中国医科大学药学院药物毒理教研室,沈阳110122;中国医科大学药学院药物毒理教研室,沈阳110122;中国医科大学药学院药物毒理教研室,沈阳110122 【正文语种】中 文 【中图分类】R96

钙调蛋白（calmodulin，CaM）是广泛存在于真核细胞内的最为重要的钙离子（Ca2+）结合蛋白，而Ca2+作为细胞内重要的第二信使参与许多细胞过程的调控，CaM通过与Ca2+结合而调节细胞内Ca2+浓度，从而广泛参与机体各种生理功能的调节［1-2］。

CaM的外形类似哑铃，有2个相似的被定义为EF-hand结构（N-lobe和C-lobe）的球形末端，中间被1个螺旋结构相连，每个EF-hand结构有2个Ca2+结构域，每个结构域可以结合1个Ca2+，即1个CaM可以结合4个Ca2+。在非刺激细胞中CaM与Ca2+结合的亲和力很低，主要以无钙离子结合钙调蛋白（apocalmodulin，ApoCaM）的形式存在，而当刺激因素使细胞中Ca2+浓度升高时，Ca2+和CaM就会结合形成钙——钙调蛋白复合物（Ca2+-CaM），引起CaM构型变化，继而改变CaM与许多效应物结合的亲和力［3-4］。CaM两端结构域有48%的相同序列和75%的同源序列，二者碳链骨架也极为相似。然而两端的不同序列也决定了它们功能的特异性，首先对Ca2+的亲和力不同：其中C-lobe与Ca2+的亲和力是N-lobe的10倍［5］；其次C-lobe和N-lobe对靶蛋白展现了不同的亲和力［6-7］，例如，在Cav1.2钙通道，Ca2+/C-lobe展现了高亲和力，而Ca2+/N-lobe展现了中低等的亲和力［8］。

早期研究［9-10］发现，CaM可直接与Cav1.2钙通道α1亚单位的C末端（CT1）和N末端（NT）结合，并且CaM和ATP能够恢复run-down的L-型钙通道的活性，但CaM是通过其N-lobe或C-lobe单独结合到钙通道起作用，

还是需要C-lobe和N-lobe同时存在，仍有待进一步阐明。因此，本研究制备了具有生物活性的N-lobe和C-lobe 2个蛋白片段，以及钙调位点突变的N-lobe12和C-lobe34无钙lobe模型，为进一步探讨N-lobe和C-lobe功能特异性提供了材料基础。 1.1 材料

pGEX-6p-3/N-lobe及pGEX-6p-3/C-lobe质粒由日本鹿儿岛大学Kameyama教授惠赠，pGEX-6p-3/N-lobe12（E31A+E67A）及pGEX-6p-3/C-lobe34（S101F+E140A）质粒由上海生工生物工程有限公司合成，氨苄西林（ampicillin，AMP）、异丙基硫代-β-D半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、溶菌酶（lysozyme，LYS）、二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）均购自Sigma公司，PreScission Protease及Glutathione-Sepharose 4B beads（GS-4B beads）购自GE Healthcare公司，其他试剂均购自BIOSHARP公司。 1.2 BL21感受态细胞的转化

分别取10 ng pGEX-6p-3/N-lobe、pGEX-6p-3/C-lobe、pGEX-6p-3/N-lobe12及pGEX-6p-3/C-lobe34加入100μL大肠杆菌BL21，冰中放置30 min，置于42℃水浴精确热击60 s，然后快速转移至冰中冷却2 min。加入37℃预温好的SOC培养基1 mL，37℃摇震荡培养1 h（160r/min），4 000r/min离心2 min，吸除部分上清培养液，剩余约200μL培养液重悬菌体，涂布含AMP 0.1mg/mL的琼脂平板培养基，37℃过夜培养。 1.3 质粒的提取

挑取经琼脂平板培养基筛选后的单克隆菌种，接种于4 mL含AMP 0.05mg/mL的LB液体培养液中，37℃、120r/min震摇培养12～16 h。取菌液1.5 m L（其余用20%甘油冻存于-20℃冰箱以保留菌种），5 000r/min离心5 min，弃尽上

清。加冰预冷的碱裂解液Ⅰ300μL剧烈涡旋震荡至沉淀均匀重悬，加新配制的碱裂解液Ⅱ300μL混匀至透明，加冰预冷的碱裂解液Ⅲ350μL混匀至内容物分散均匀，置于冰上3～5 min至出现白色沉淀。15 000r/min、4℃离心10 min后取上清与等量体积的酚：氯仿振荡混合，15 000r/min、4℃离心2 min后取上清与2倍体积量的无水乙醇振荡混合，室温放置2 min。15 000r/min、4℃离心10 min后弃上清，沉淀的核酸中加70%乙醇1 mL清洗，15 000r/min、4℃离心2 min后室温干燥10～15 min至乙醇完全挥发。用含RNaseA（20 μg/mL）的灭菌水重新溶解核酸，温和振荡数秒钟，取部分再次稀释一定比例后，测质粒DNA吸光度（A）值，稀释到500 ng/μL，其余部分于-20℃冰箱保存。 1.4 质粒的鉴定

1.4.1 酶切鉴定：重组质粒具有NotⅠ、BstBⅠ及EcoRⅠ限制性酶切位点，pGEX-6p-3/N-lobe和pGEX-6p-3/C-lobe选用EcoRⅠ酶切，pGEX-6p-3/N-lobe12和pGEX-6p-3/C-lobe34选用NotⅠ和BstBⅠ双酶切后，进行琼脂糖电泳鉴定。

1.4.2 测序鉴定：将冷冻保存的菌液送公司进行DNA测序，测序结果用BLAST分析同源性。 1.5 蛋白表达及纯化

1.5.1 蛋白表达：取适量菌种加入装有400 mL LB（含AMP 50 μg/mL）培养液的锥形瓶中，37°C、120r/min震摇培养12～16 h。当A595值在0.6～1.0时，加入IPTG至1 mmol/L，37℃、120r/min震摇培养4 h，诱导融合蛋白表达。 1.5.2 蛋白纯化：所有操作均在冰上进行，所有离心均为4°C离心。取400 m L菌液5 000r/min离心10 min后弃上清，用20 mL PBS重悬沉淀菌体，加入溶菌酶至1 g/L，冰浴30 min。200 W超声20 min打破菌体（超声3 s停7 s），16 000r/min离心10 min，取上清与两管300μL GS-4B beads（预先用PBS洗

2次）混合后置10r/min的旋转培养器室温孵育1 h。600r/min离心3 min后弃上清，洗5次后每管加入495μL PBS和5μL PreScission Protease，混匀后置水平摇床室温剧烈震摇5 h。600r/min，离心3 min，取上清即目的蛋白于-80℃冻存。常规15%SDSPAGE电泳检测纯化后的蛋白纯度及相对分子量。参照Bradford蛋白浓度测定试剂盒方法测定纯化后的蛋白浓度。 1.6 蛋白活性鉴定

1.6.1 Pull-down方法检测蛋白结合活性：取连接于beads上的NT 50μL于2 mL的EP管中，加入10 μmol/L的N-lobe（C-lobe、N-lobe12、C-lobe34）及含2 mmol/L［Ca2+］的Tris buffer至300μL。液体中游离［Ca2+］经WEBMAXC v2.10软件计算获得。将2 mL EP放于旋转培养器上，10r/min，4°C，4 h。600r/min，3 min，弃上清。含2 mmol/L［Ca2+］的Tris buffer轻洗2次，beads用15μL 1×SDS样品缓冲液洗脱，上清加于15%SDS-PAGE电泳确认［11］，检测lobe蛋白是否仍具有结合活性。

1.6.2 Patch-clamp方法检测蛋白生理活性：应用膜片钳单通道记录模式监测钙通道活性。检测N-lobe、C-lobe、N-lobe12、C-lobe34对“run-down”Cav1.2钙通道的恢复作用［12］。 2.1 重组质粒的酶切鉴定

质粒pGEX-6p-3大小为4 983 bp，经SalⅠ/XhoⅠ酶切插入N-lobe基因序列（240 bp），经BamHⅠ/NotⅠ酶切插入C-lobe（219 bp），N-lobe12（240 bp）及C-lobe34（219 bp）基因序列。进行琼脂糖电泳鉴定质粒，pGEX-6p-3/N-lobe和pGEX-6p-3/C-lobe选用EcoRⅠ酶切，pGEX-6p-3/N-lobe12和pGEX-6p-3/C-lobe34选用NotⅠ和BstBⅠ双酶切。质粒pGEX-6p-3第963号碱基开始为SalⅠ酶切位点，968号碱基开始为XhoⅠ酶切位点，945号碱基开始为BamHⅠ酶切位点，973号碱基开始为NotⅠ酶切位点，953号碱基开始为

EcoRⅠ酶切位点，954号碱基开始为BstBⅠ酶切位点；N-lobe第31号碱基开始为ECoRⅠ酶切位点。故重组pGEX-6p-3/N-lobe质粒全长：4 983-（968-963）+240=5 218 bp，经EcoRⅠ酶切后得：2个碱基片段，分别为963-953+30=40 bp及5 218-40= 5 178 bp，其中因40 bp碱基片段太小，酶切经琼脂糖凝胶电泳后丢失，琼脂糖凝胶电泳图上只在大约5 200 bp出现条带（图1A）；重组pGEX-6p-3/C-lobe质粒全长：4 983-（973-945）+219=5 174 bp，C-lobe上没有ECoRⅠ，经EcoRⅠ酶切后得到1个5 173 bp大片段（图1A）；pGEX-6p-3/N-lobe12质粒全长4 983-（973-945）+240=5 195 bp，经NotⅠ和BstBⅠ双酶切后有2个片段，分别为973-654-（973-945）+240= 531 bp及5 195-531=4 664 bp（图1B）；pGEX-6p-3/C-lobe34质粒全长：4 983-（973-945）+219=5 174 bp，经NotⅠ和BstBⅠ双酶切后有2个片段，分别为973-654-（973-945）+219=510 bp及5 195-510=4 685 bp（图1C）。 2.2 重组质粒的测序鉴定

碱基测序结果如图2所示，红色标记的碱基为突变位点。根据测得的碱基序列及3个碱基决定1个氨基酸的原则，获得N-lobe，C-lobe氨基酸顺序（图3）。其中方框内的为钙结合位点，共4个钙结合位点，每个钙结合位点由12个氨基酸组成；红色标记的氨基酸为突变位点。碱基测序结果与BLAST软件比对，N-lobe和C-lobe测序结果与Homo sapiens calmodulin 2（CALM2）完全一致（图2A）；N-lobe12在CALM2基因序列的第163、271个碱基由A突变成C（图2），相对应的第31、67个氨基酸残基均由E突变成A（图3）；C-lobe34在CALM2基因序列的第372个碱基由A突变成T、第373个碱基由G突变成T、第490个碱基由A突变成C（图2），其中前2个碱基的共同突变使其相对应第101个氨基酸残基由S突变成F，最后1个碱基的突变使其相对应的第140个氨基酸残基由E突变成A（图3）。测序结果进一步证明重组质粒构建成功。

2.3 纯化后蛋白纯度和浓度测定

N-lobe、C-lobe及其突变体蛋白表观分子量约为9×103，纯化后蛋白经15%SDS-PAGE电泳，结果如图4显示，条带位置与预期结果一致，且杂带较少即纯度较高、表达量大，经上述鉴定，初步认为提纯获得N-lobe、C-lobe、N-lobe12和C-lobe34蛋白。

采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒方法测定提纯蛋白浓度，其中N-lobe浓度为0.46 g/L；N-lobe12浓度为0.44 g/L；C-lobe浓度为0.82 g/L；C-lobe34浓度为0.78 g/L。

2.4 纯化后蛋白的活性鉴定

GST pull-down结果如图5所示，纯化后的N-lobe、C-lobe、N-lobe12和C-lobe34在2 mmol/L［Ca2+］下均可与NT结合，且C-lobe的结合最显著，N-lobe次之，N-lobe12和C-lobe34较弱。Patch Clamp结果显示纯化后蛋白均可恢复已run-down的心肌钙通道活性。以上结果说明本研究纯化后得到的蛋白均具有生物活性。

CaM是一种广泛存在于生物体的钙结合蛋白，研究［11-15］表明CaM通过结合到Cavs的α1亚型的N末端及C末端而介导了Ca2+依赖性易化（Ca2+-dependent facilitation，CDF）和Ca2+依赖性失活（Ca2+-dependent inactivation，CDI）。

研究［16-19］表明CaM的C-lobe和N-lobe可以单独调节通道的CDF和CDI，Ca2+结合到CaM的N-lobe和C-lobe引起不同的调节，C-lobe介导L型钙通道（Cav1.x）CDI，而介导非L型钙通道（Cav2.x）CDF［19］。但前期研究［11，14］在用膜片钳方法观察CaM的钙结合位点突变体对CaV1.2易化和失活作用时发现通道的Ca2+依赖性调节需要CaM的C-lobe和N-lobe同时存在。除了C-lobe和N-lobe在功能上的不同，对于Cavs钙通道上的各个CaM结合位

点也展现了不同的亲和力。例如，在Cav1.2钙通道，Ca2+/C-lobe展现了高亲和力，而Ca2+/N-lobe展现了中低等的亲和力［8］。因此，关于CaM的lobe特异性地调节CDF和CDI的机制有待进一步阐明。

以上研究均以突变CaM的1、2位钙结合位点模拟C-lobe模型，以突变CaM的3、4位钙结合位点模拟N-lobe模型，因有研究［20］表明无钙CaM

（ApoCaM）亦可调节通道开放，考虑到1、2位钙结合位点突变丧失钙结合能力后的N末端或3、4位钙结合位点突变丧失钙结合能力后的C末端仍可能存在生物活性，本研究制备CaM的两端蛋白片段而非在完整结构CaM基础上突变钙结合位点来模拟N-lobe及C-lobe模型。本研究质粒构建并转化成功，蛋白高表达，纯化后蛋白高纯度、高浓度并且具有结合活性及电生理活性，为后续研究CaM 2个lobe的功能特异性奠定了基础。

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