食品与药品 Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ ２０１４年第ｌ６卷第３期 １ ７１ 达肝素钠分子量及分子量分布的测定与计算方法改进 宋志新，丁建文，管惠娟，张超，王武萍 （常山生化药业（江苏）有限公司，江苏常州２１３１４９） 摘要：目的建立用高效分子排阻法测定达肝素钠分子量与分子量分布的方法，并与欧洲药典（ＥＰ）７．０版低分子肝素 专论中的方法比较。方法采用高效分子排阻法，示差检测器，色谱柱ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷ （３００ ｍｍ×７．８ ｍｍ，５ ｇｍ）和 ＴＳＫＧ２０００ＳＷｘｔ（３００ ｍｍ×７．８ ｍｉｌｌ，５邶１）串联，柱温３０℃，流动相０．１ ｍｏｌ／Ｌ乙酸铵溶液，流速０．５ ｍＬ／ｍｉｎ。结果方法 专属性强，重复性试验中重均分子量（ ）的ＲＳＤ为０．６％，Ｍｗ＜３０００级分比例的ＲＳＤ为２．１％，＾ ３０００－８０００级分比例的 ＲＳＤ为０．９％，样品测定结果与ＥＰ７．０方法测定结果接近。结论本方法操作简便，重复性好，结果准确可靠，可用于测定达 肝素钠分子量与分子量分布。 关键词：高效分子排阻法；达肝素钠；分子量；分子量分布 中图分类号：Ｒ９１７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７２－９７９Ｘ（２０１４）０３－０１７１－０３ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ Ｉｔｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｄａｌｔｅｐａｒｉｎ Ｓｏｄｉｕｍ ＳＯＮＧ Ｚｈｉ—ｘｉｎ，ＤＩＮＧ Ｊｉａｎ—ｗｅｎ，ＧＵＡＮ Ｈｕｉ－ｊｕａｎ，ＺＨＡＮＧ Ｃｈａｏ，ＷＡＮＧ Ｗｕ—ｐｉｎｇ （Ｃｈａｎｇｓｈａｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ（Ｊｉａｎｇｓｕ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ ２１３１４９，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｄａｌｔｅｐａｒｉｎ ｓｏｄｉｕｍ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｌｉｓｔｅｄ ｉｎ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（ＥＰ）７．０．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｉｚｅ—ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｒｅｔｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｕｓｅｄ．Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｏｎ ａ ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷｘＩ． ｃｏｌｕｍｎ（３００ ｍｍ×７．８ ｍｍ，５ ｍ）ｉｎ ｓｅｒｉｅｓ ｗｉｔｈ ａ ＴＳＫ Ｇ２０００ＳＷｘＬ ｃｏｌｕｍｎ（３００ ｍｍ×７．８ ｍｍ，５岬）ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ３０℃．Ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｗａｓ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ．ｗｉｔｈ ａ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｏｆ ０．５ ｍＬ／ ａｉｒｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｓｐｅｃｉｉｆｃ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＲＳＤ ｆｏｒ ｗｅｉｇｈｔ ａｖｅｒａｇｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ（Ｍｗ）ｏｆ ０．６％，ａｎｄ ｔｈｅ ＲＳＤ ｆ０ｒ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｍｗ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ３０００ ａｎｄ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ３０００－８０００ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｗｅｒｅ ２．１％ａｎｄ ０．９％．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｃｌｏｓｅｄ ｔｏ ｔｈｏｓｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｌｉｓｔｅｄ ｉｎ ＥＰ ７．０． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ，ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ，ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｄａｌｔｅｐａｒｉｎ ｓｏｄｉｕｍ． Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ：ｓｉｚｅ—ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ｄａｌｔｅｐａｆｉｎ ｓｏｄｉｕｍ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ 达肝素钠是低分子肝素钠盐，由猪肠黏膜提取 Ｕ３０００高效液相色谱仪（美国Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）； 的肝素经亚硝酸解聚而得。临床主要用于治疗急性深 ＲＩ．１０１示差检测器（日本Ｓｈｏｄｅｘ）；超纯水系统（美 静脉血栓，治疗不稳定型冠状动脉疾病，预防与手术 国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；ＡＬＣ一２１０．４电子天平（瑞士梅特勒．托 有关的血栓形成等。其分子量与分子量分布是该产品 利多）；低分子肝素分子量测定用对照品（ＮＩＢＳｃ， 的重要特征，目前测定分子量与分子量分布普遍采用 批号０５／１１２）；乙酸铵（分析纯，国药集团）；水为 ＥＰ７．０收录方法，其原理是使用紫外检测器与示差检 超纯水；达肝素钠（批号ＤＳ．１１０５０１，ＤＳ．１１０５０２， 测器串联，利用对照品在２个检测器上的响应信号，ＤＳ—ｌｌ０５０３，ＤＳ．２０１３００２），由常山生化药业（江 经公式计算，建立校正曲线【】 】。我们采用英国国家 苏）有限公司研制。 生物制品检定所（ＮＩＢＳｃ）对照品及附带的宽分布标 ２方法与结果 样表，即分子量与累积面积百分比的对应表，只使用 ２．１色谱条件 示差检测器即可完成测定，操作简便。 １仪器与试剂 收稿日期：２０１４．０２．１７ 基金项目：江苏省科技项目：抗血栓新药达肝素钠原料药的研究（ＢＥ２０１１６５８） 作者简介：宋志新（１９８０．），女，满族，辽宁本溪人，主管药师，从事药品研发工作Ｔｅｌ：０５１９．８６５６０７０８ Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｏｎｇｚｘ＠ｃｓｂｉｏ．ｃｏｒｎ．ｃ玎 色谱柱ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷｘＬ（３００ ｍｍ×７．８ ｍｍ，５ ｇｍ）和ＴＳＫ Ｇ２０００ＳＷｘＬ（３００ ｍｍ￣７．８ ｍｉｌｌ，５ ｇｍ） １７２ 食品与药品 Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ ２０１４年第ｌ６卷第３期 先后串联，示差检测器，柱温３０℃，流速０．５ ｍＬ／ 离度较好，见图１。 ｍｉｎ，进样体积２５ ，流动相０．１ ｍｏｌ／Ｌ７，酸铵溶液。 ２．２溶液制备 ２．２．１对照品溶液制备取低分子肝素分子量测定用对 照品适量，精密称定，用流动相溶解并定量稀释成每 １ ｍＬ约含１０ ｍｇ的溶液。 ２．２．２供试品溶液制备取达肝素钠适量，精密称定， 加流动相溶解并定量稀释成每１ ｍＬ约含１０ ｍｇ的溶 液。 ２．３计算 使用低分子量肝素钠ＮＩＢＳＣ对照品提供的宽分布 表（见表１），识别对照品色谱图中与宽分布表中累 积面积百分比最接近点的保留时间（ ），与表中对 应分子量的对数值进行３次多项式拟合，计算公式中 的ａ，ｂ，Ｃ，ｄ值。 Ｌｏｇ１ ａ十ｂ× Ｔ＋ｃ Ｘ ＲＴｚ＋ｄ× Ｔ’ 式中 为分子量。按上式计算供试品色谱图中保 留时间ｉ点的分子量。按下式计算样品的重均分子量 （Ｍｗ）。 Ｍｗ＝Ｚ（ｍｉ×Ｍｉ）／ＥＲ／ｉ 式中， 为ｉ点响应值； 为ｉ点分子量 表１ ＮＩＢＳＣｔＩ￣分子肝素钠对照品（０５／１１２）宽分布标 样表 注： 为分子量 ２．４专属性试验 分别精密量取空白溶液，对照品溶液、供试品 溶液各２５ ，分别注入液相色谱仪，空白溶液在主 峰位置无干扰，对照品溶液中主峰与溶剂峰、盐峰分 Ａ：空白溶液色谱图；Ｂ：对照品溶液色谱图；Ｃ：供试品 溶液色谱图 图１空白溶液、对照品溶液、供试品溶液的ＨＰＬＣ色 谱图 ２．５精密度试验 ２．５．１进样精密度精密称取低分子肝素钠分子量测 定对照品２０ ｍｇ，置入２ ｍＬ量瓶，加流动相溶解并 稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，按２．１项色谱 条件连续进样６次，计算６次峰面积的相对标准偏差 （Ｒ ）），结果见表２。 表２进样精密度试验结果 序号 １ ２ ３ ４ ５ ６ ＲＳＤ／％ 峰面积５０．０８０ ５０．５５ １ ５０．４３５ ５０．０３８ ５０．４５８ ５０．６０９ ０．５ ２．５．２重复性精密称取达肝素钠样品（批号：ＤＳ． １ １０５０１）２０ ｍｇ，置入２ ｍＬ量瓶，加流动相溶解并稀 释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，平行配ｑ６１Ｊ６份溶 液，按２．１项色谱条件分别测定，结果见表３。 食品与药品 Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ ２０１４年第ｌ６卷第３期 ｌ７３ 表３重复性试验结果 用２根色谱柱串联，有利于使样品与盐和溶剂峰达到 基线分离，为获得准确可靠的结果打下基础。 ３．２ ＥＰ７．０采用数均分子量为３８００的宽分布对照品， 利用紫外和示差检测器串联，根据紫外和示差色谱图 的峰面积计算对照品色谱图中每个时间点的分子量， 通过对保留时间与每个时间点分子量的３次多项式拟 合，得到校正曲线。其计算方法没有涉及具体细节， 例如怎样确定紫外和示差检测器串联的时间差，制作 ２．６本方法与ＥＰ７．０方法测定结果比较 标准曲线中分子量选取的范围及选取方式等，因选择 分别用本方法￣ＩＥＰ７．０收录方法测定４批达肝素钠 的差异均可影响测试结果。本方法虽也用宽分布对照 样品的分子量与分子量分布，结果见表４。 品，但对照品说明书提供了宽分布标样表，即分子量 表４两种分子量与分子量分布测定方法比较 与累积面积百分比对应表，可通过标样表中的累积面 积值找到对应的保留时间，再用标样表中的分子量与 保留时间建立标准曲线，方法简单，省去了很多中间 计算环节，减少了建立标准曲线所致的测定结果差 异。 ３．３本法采用示差检测器，基线稳定对测定结果影响 较大，因此，测定过程中要保持温度恒定。 ３．４本方法测定结果与ＥＰ７．０方法测定结果较接近， 但具有简便、重现性好等特点。 ３讨论 参考文献 ３．１本方法和ＥＰ７．０使用的均为宽分布低分子肝素分 川１ 李京，王悦，宋玉娟，等．低分子肝素注射剂质量评价［Ｊ］．药物分 子量对照品，ＥＰ７．０只用１根色谱柱，根据我们的实 析杂志，２０１３，３３（１０）：１７６８－１７７３． 践，样品与盐和溶剂峰很难达到基线分离。本方法采 ［２】ＥＰ７．０．Ｈｅｐａｒｉｎｓ ｌｏｗ—ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｍａｓｓ［Ｓ］．２０１１：２１５１・２１５３． 投稿注意事项 １．来稿可通过电子邮件发至本刊。同时邮寄一份纸稿，附作者书面声明“来稿未投他刊”，以及单位介绍信。请 注明作者地址、邮编、Ｅ．ｍａｉｌ￣Ｉ联系电话（最好提供手机号码）。 ２．凡接到本刊收稿回执后３个月内未收到稿件处理通知，说明此稿件仍在审阅中。作者如欲改投他刊，须来信（挂 号）与我刊联系。作者可通过Ｅ．ｍａｉｌ或电话查询审稿进度。 ３．依照著作权法有关规定，本刊可修改稿件文字，凡涉及原意的修改请作者考虑。作者文责自负。 ４．凡退回作者修改的稿件，务请１个月内修回，如有问题请通过电子邮件联系。 ５．本刊收取稿件处理费，每篇５０元，请通过邮局汇款至我刊编辑部，在汇款单上注明第一作者姓名和文题。对于 决定录用的稿件，本刊将收取版面费。稿件刊登后，赠本刊。 ６．本刊入编中国核心期刊（遴选）数据库，作者如不同意将文章入编，投稿时敬请说明。 ７．来稿请寄：山东省济南市高新开发区新泺大街９８９号《食品与药品》编辑部，邮编：２５０１０１；电话／传真： （０５３ １）８８７７９１２５ Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｏｏｄ＿ｄｒｕｇ＠ｓｉｎａ．ｏｏｍ．