华南师范大学学报（自然科学版） ２０１１年８月 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＳＯＵＴＨ ＣＨＩＮＡ ＮＯＲＭＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳｎＹ ２０１１年第３期 Ａｕｇ．２０１１ （ＮＡＴＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ ＥＤＩＴＩＯＮ） Ｎｏ．３，２０１１ 文章编号：１０００．一５４６３（２０１１）０３—０１２３—０４ ＡｈＡ０２融合蛋白表达、纯化与抗体制备 杨丽霞 ，周文灵 ，宋涛平 ，彭新凯 ，胡朝晖 （１．长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南长沙，４１００１３； ２．华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广东广州，５１０６３１；３．广州甘蔗糖业研究所，广东广州，５１０３１６） 摘要：构建ＡｈＡＯ２基因片段原核表达重组质粒ｐＰＲＯＥＸ—Ｈｔａ—ＡｈＡＯ２，表达质粒在Ｅ ｃｏｌｉ ＢＩ２１中诱导表达，获得 Ｈｉｓ—ＡｈＡＯ２融合蛋白，采用亲和层析与电泳纯化Ｈｉｓ—ＡｈＡＯ２免疫，新西兰大白兔，获得抗Ｈｉｓ—ＡｈＡ０２抗体，Ｗｅｓｔ・ ｅｒＲ ｂｌｏｔ检测显示其只与Ｈｉｓ—ＡｈＡＯ２融合蛋白结合．实验成功制备了抗ＡｈＡＯ２特异抗体． 关键词：花生；ＡｈＡＯ２；ｐＰＲＯＥＸＨＴａ；原核表达；抗体 中图分类号：Ｑ７８ 文献标志码：Ａ 近年来，确认玉米黄质环氧化酶（ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ ｅｐ． １．２主要试剂 ｏｘｉｄａｓｅ，ＺＥＰ），９一顺环氧类胡萝卜素双加氧酶（９一 镍亲和层析柱购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司．各种ＤＮＡ限 ｃｉｓ—ｅｐｏｘｙｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ＮＣＥＤ）、短链醇脱 制性内切酶、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、ＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶， 氢 还原酶（ｓｈｏｒｔ—ｃｈａｉｎ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅ— ＤＮＡ标准相对分子量购自ＴａＫａＲａ公司．蛋白标准 ｄｕｅｔａｓｅ，ＳＤＲ）和ＡＢＡ醛氧化酶（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｏｘｉｄａｓｅ，ＡＢＡＯ）催化的反应是高等植物脱落酸 相对分子量购自天根生化科技有限公司．引物合成 （ＡＢＡ）生物合成途径的重要步骤¨Ｉ２ Ｊ．其中由 及序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成． ＡＢＡＯ催化ＡＢＡ生物合成的最后一步反应，将ＡＢＡ １．３ ｐＰＲＯＥＸ—Ｈｔａ—ＡｈＡ０２重组表达载体构建 醛氧化为ＡＢＡ． 采用以下引物ＰＣＲ扩增花生ＡｈＡＯ２基因片段 醛氧化酶（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｏｘｉｄａｓｅ，ＡＯ）是钼单加氧酶 （ＯＲＦ中位置为１９６—２０７９，基因片段１ ８８４ ｂｐ）：上 和Ｆｅ—Ｓ黄素蛋白家族的成员之一 ３ Ｊ，涉及到多种 游引物ＨＴａＡＯ３：５ 一ＧＡＡ ＴＩ＇Ｃ Ａ１Ｔｒ ＧＡＡ ＧＡＣ ＩＴｒｒ 化合物的代谢过程．目前认为在植物中ＡＯ主要参 ＡＣＧ ＧＣＧ ＡＧＴ ＴＣＴ ＴＧＣ一３ ，下游引物ＨＴａＡ０４：５ 与ＡＢＡ和ＩＡＡ的生物合成．对拟南芥和豌豆ＡＯ响 一ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＡ Ｇ ＩＴ ＴＣＴ ＧＡＧ ＴＡＴ ＣＴＧ 应逆境胁迫和底物特异性研究发现，拟南芥ＡＯ８＿４ ＣＡＡ ＣＣＡ Ｃ一３ ．扩增产物回收后，经ＥｃｏＲ Ｉ和 和豌豆ＰＡＯ一３Ｉｓ］具有ＡＢＡＯ活性，并从拟南芥 Ｐｓｔ Ｉ酶切后，与原核表达载体ｐＰＲＯＥＸＨＴａ连接， 和豌豆 克隆了该基因．作者前期从抗旱花生品种 转化Ｅ．ｃｏｌｉ，并测序验证． 中首次克隆ＡｈＡ０２基因（ＧｅｎＢａｎｋ登记号 １．４ Ｈｉｓ ＡｈＡｏ２融合蛋白的表达和纯化 ＥＵ８１６１９６），本文构建Ａ Ｄ２基因片段ｐＰＲＯＥＸ— 取含ｐＰＲＯＥＸ—Ｈｔａ—ＡｈＡ０２重组质粒的菌液， Ｈｔａ—ＡｈＡ０２原核表达质粒，获得原核表达重组蛋 白，制备抗体，为研究花生在干旱、盐等胁迫条件下 按１：１００扩大培养３ ｈ，加入异丙基一Ｂ—Ｄ一硫代 的ＡｈＡ０２蛋白表达和作用奠定基础． 半乳糖苷（ＩＰＴＧ）至终浓度为１ ｍｍｏｌ／Ｌ，诱导表达 ４ ｈ离心收集菌体，酶解法破碎后，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离 １材料与方法 心５ ｒａｉｎ，沉淀用Ｎｏｖａｇｅｎ公司的Ｓｕｐｅｒｔｌｏｗ柱纯化， 进行７．５％ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析蛋白质． １．１菌株、质粒和材料 １．５ 多克隆抗体的制备 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、ｐＰＲＯＥＸＨＴａ质粒为本实验室 取原核表达过柱后的组分进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电 保存． 泳，然后切下目标蛋白条带，一８０℃冻存待用．将切 收稿日期：２０１０—１１—１７ 基金项目：教育部科学技术研究重点项目（０３０９８）；广东省教育厅”千百十工程”优秀人才培养基金项目（Ｑｏ２ｏ９ｏ） 通讯作者，ｙａｎｇｌｉｘｉａ６１２＠１６３．ｃｏｒｎ １２４ 华南师范大学学报（自然科学版） ２ ３ ４ 下的凝胶块于研钵中研碎，加入等体积ＰＢＳ，研磨混 匀后，再加入等体积弗氏完全佐剂，用注射器反复吸 打，充分混匀待用．在每只兔的背部取１０个点进行 皮下注射抗原一佐剂混合物，每个点１００—２００ ｐ，Ｌ 样液．初次免疫１０ ｄ后，取初次免疫抗原用量的 ４ ５００ ｂｐ ２ ２５０ ｂｐ １ ５００ ｂｐ １／５，与弗氏不完全佐剂混匀，进行第１次加强免疫 注射．１０ ｄ后同上进行第２次加强免疫注射．３ ｄ后， Ｍ：２５０ ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ；１：ＰＣＲ空白对照（ＰＣＲ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏ１）；２：重 心脏采血，分离出血清． １．６ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ 纯化的Ｈｉｓ—ＡｈＡＯ２融合蛋白用质量分数为 ７．５％聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后用电转移方法将 分离的蛋白转移到ＰＶＤＦ膜上，２ ｍＡ／ｃｍ 转移１ ｈ． 用含体积分数为５％脱脂奶粉的ＴＢＳＴ封闭膜上未 结合蛋白的位点，ＴＢＳＴ（２０ ｍｍｏＶＬ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１（ｐＨ ７．５）、１５０ ｍｍｏ￣Ｌ ＮａＣ１、体积分数为０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）．将一抗稀释２ ０００倍后做免疫检测．膜与一抗 于室温孵育１ ｈ后，４℃放置过夜．用ＴＢＳＴ洗３次， 每次５～１０ ｍｉｎ．二抗是碱性磷酸酶连接的羊抗兔 ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ公司），用ＴＢＳＴ稀释１ ０００倍后使用．膜 与二抗室温孵育１ ｈ．用ＴＢＳＴ洗３次，每次５～ １０ｍｉｎ，用ＴＢＳ（２０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１（ｐＨ ７．５），１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣＩ）漂洗膜以去除膜表面的Ｔｗｅｅｎ ２０．免 疫复合体用碱性磷酸酶反应试剂盒（天根生化科 技）显色．拍摄滤膜照片留作永久实验记录． ２结果与分析 ２．１ ｐＰＲＯＥＸ—Ｈｔａ—ＡｈＡＯ２原核表达载体构建 将原核表达载体ｐＰＲＯＥＸＨＴａ用内切酶酶切并 回收载体片段，与回收的ＡｈＡＯ２基因片段于１６℃ 连接过夜．转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１，挑取单菌落摇菌．取１ Ｌ菌液用引物ＨＴａＡＯ３和ＨＴａＡＯ４做ＰＣＲ检测， 确认ＡｈＡ０２基因片段已克隆到表达载体中，抽提质 粒，进行ＥｃｏＲ Ｉ和Ｐｓｔ Ｉ双酶切鉴定（图１）． ２．２ Ｈｉｓ—ＡｈＡＯ２融合蛋白的诱导表达与纯化 诱导表达后的菌液经酶解处理，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分 析结果表明，出现１条相对分子量大约为７５×ｌＯ 的蛋白条带，区别于表达空载体菌株，与目标融合蛋 白Ｈｉｓ—ＡｈＡＯ２的预期大小相符（图２）． 将包涵体蛋白用Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ柱纯化，得到的Ｄｌ、 Ｄ３、Ｅ１和Ｅ３溶液进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ．与图２未纯化 蛋白相比，得到的包涵体蛋白纯度较高（图３），此蛋 白可用于后面的抗体制备和检测． 组质粒ＰＣＲ检测（ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｐＰＲＯＥＸ—Ｈｔａ—ＡｈＡ０２）；３：重组 质粒ＤＮＡ（ｐＰＲＯＥＸ—Ｈｔａ—ＡｈＡＯ２ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ）；４：重组质粒ＥｃｏＲ Ｉ和Ｐｓｔ Ｉ双酶切（Ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＥｃｏＲ Ｉ＋Ｐｓｔ Ｉ） 图１ ｐＰＲＯＥＸ—Ｈｔａ—ＡｈＡＯ２重组质粒鉴定 Ｆｉｇｕｒｅ １ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｐＰＲＯＥＸ——Ｈｔａ——ＡｈＡＯ２ Ｍ １ ２ ３ ４ ５ ９４ ０ｘ１０ ６６ ２ｘ１ Ｍ：蛋白Ｍａｒｋｅｒ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ）；１：ｐＰＲＯＥＸＨＴａ菌体总蛋白（Ｔｏｔａｌ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ ｏｆ ｐＰＲＯＥＸＨＴａ）；２：ｐＰＲＯＥＸ—Ｈｔａ—ＡｈＡＯ２诱导前菌体总 蛋白（Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＢＬ２１ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｐＢＲＯＥＸ—Ｈｔａ—ＡｈＡＯ２）； ３：ｐＰＲＯＥＸ—Ｈｔａ—ＡｈＡＯ２诱导后菌体总蛋白（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆＩＰＴＧ—ｉｎ— ｄｕｃｅｄ ＢＬ２１ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｐＰＲＯＥＸ～Ｈｔａ—ＡｈＡＯ２）：４：ｐＰＲＯＥＸ— Ｈｔａ—ＡｈＡＯ２诱导后菌体可溶性蛋白（Ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＩＰＴＧ—ｉｎ— ｄｕｃｅｄ ＢＬ２１ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｐＰＲＯＥＸ～ｔｈａ—ＡｈＡＯ２）；５：ｐＰＲＯＥＸ— Ｈｔａ—ＡｈＡＯ２诱导后菌体包涵体蛋白（Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＩＰＴＧ—ｉｎ— ｄｕｃｅｄ ＢＬ２１ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｐＰＲＯＥＸ～Ｈｔａ—ＡｈＡＯ２） 图２ Ｈｉｓ—ＡｈＡＯ２融合蛋白的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳 Ｆｉｇｕｒｅ ２ ＳＤＳ——ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｉｓ——ＡｈＡ０２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍ Ｄ１ Ｄ３ Ｅ１ Ｅ３ ９４ ０×ｌ０ ６６－２×１０ Ｍ：蛋白Ｍａｒｋｅｒ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ）；Ｄ１、Ｄ３、Ｅ１、Ｅ３为过柱后得到的蛋白 组分（Ｄｌ，Ｄ３，Ｅ１，Ｅ３ ａｒｅ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ） 图３ ｐＰＲＯＥＸ—Ｈｔａ—ＡｈＡＯ２原核表达过柱后的Ｄ１、Ｄ３、 Ｅ１、Ｅ３组分 Ｆｉｇｕｒｅ ３ Ｄ１，Ｄ３，Ｅ１ ａｎｄ Ｅ３ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｓ—ＡｈＡＯ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｅｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｅ ｃｏｉｌ 第３期 杨丽霞等：ＡｈＡ０２融合蛋白表达、纯化与抗体制备 １２５ ２．３ Ｈｉｓ—ＡｈＡＯ２抗血清的制备及检测 经ＥＬＩＳＡ检测，制备的抗血清效价达１／１０ ０００． Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析的结果表明，ｌ：１０ ０００稀释的抗体 与诱导表达的Ｈｉｓ—ＡｈＡ０２融合蛋白有特异的抗原 抗体反应． Ｍ 。 誊 。 ９５× ７２× ５５× Ｍ：蛋白标准（ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ）；１：纯化后Ｈｉｓ—ＡｈＡ０２融合蛋白（Ｐｕ— ｒｉｌｆｅｄ Ｈｉｓ—ＡｈＡ０２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ） 图４抗ＡｈＡ０２血清的Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ Ｆｉｇｕｒｅ ４ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｏｆ ＡｈＡＯ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ３讨论 在高等植物中，醛氧化酶是个蛋白家族，它们区 别于电泳迁移率、底物特异性、亚基组成．醛氧化酶 多态性的存在及其底物特异性不同，可能与它们在 植物生长发育中起的不同作用有关 Ｊ．拟南芥中 ＡＡＯｓ基因有４个成员（ＡＡ０１—４），其中ＡＡ０３编码 的蛋白质ＡＯ８具有ＡＢＡＯ活性 ．豌豆中有３个 ＰｓＡＯｓ基因（ＰｓＡＯ１—３），其中ＰｓＡ０３编码的蛋白质 ＰＡＯ一３具有ＡＢＡＯ活性，同时运用拟南芥ＡＡ０２ 抗体识别豌豆醛氧化酶异构体，分析豌豆醛氧化酶 蛋白表达水平在胁迫条件下的变化，与酶活性变化 进行比较，发现ＰＡ０—３响应逆境胁迫 ’ ． 本实验完成原核表达载体ｐＰＲＯＥＸ—Ｈｔａ— ＡｈＡ０２的构建，证实表达载体在ＢＩ２１中高效表达， 获得基因表达的融合蛋白．进一步应用亲和柱将表 达的融合蛋白分离，得到纯化的目的蛋白．用所表达 的融合蛋白免疫兔，制备了相应的多克隆抗体． ＡｈＡ０２抗体可识别Ｈｉｓ—ＡｈＡＯ２融合蛋白，说明获 得的抗体可用于研究花生ＡｈＡＯ２蛋白组织特异性 及响应逆境表达水平变化，可分别从蛋白表达水平 和酶活性对其进行分析．由于ＡｈＡ０２蛋白催化 ＡＢＡ生物合成途径的最后一步，其细胞免疫组织化 学定位可直接反应ＡＢＡ生物合成器官特异性，通过 与水分胁迫条件下ＡＢＡ的作用部位比较，对研究 ＡＢＡ在植物体内的运输有重要作用． 参考文献： ［１］ＧＲＯＳＳＭＡＮＮ Ｋ，ＳＣＨＥＬＴＲＵＰ Ｆ，ＫＷＩＡＴＫＯＷＳＫＩ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｂｓｅｉｓｉｃ ａｃｉｄ ｉｓ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｕｘｉｎ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ ｉｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， １９９６，１４９：４７５—４７８． ［２］ ＮＡＭＢＡＲＡ Ｅ，ＭＡＲＩＯＮ—ＰＯＬＬ Ａ．Ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｏ— ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ［Ｊ］．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ， ２００５，５６：１６５—１８５． ［３］ ＯＭＡＲＯＶ Ｒ Ｔ，ＡＫＡＢＡ Ｓ，ＫＯＳＨＩＢＡ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ａｉｄｅ・ ｈｙｄｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｉｎ ｒｏｏｔｓ，ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｓｅｅｄｓ ｏｆ ｂａｒｌｅｙ（ｔｔｏｒ－ ｄｅｕｍ ｗｌｇａｒｅ Ｌ）［Ｊ］．Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ， １９９９，５０：６３—６９． 一 ［４］ＳＥＯ Ｍ，ＰＥＥＴＥＲＳ Ａ Ｊ Ｍ，ＫＯＩＷＡＩ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ Ａｒａ— ｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｌｄｅｈｙｄｅ眦 哪ｅ ３（Ａ４０ｌ３）ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｃａｔａｌｙ— ｚｅｓ ｔｈｅ ｆｉｎａｌ ｓｔｅｐ ｉｎ ａｂｓｅｉｓｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｉｌ Ａｃａｄ Ｓｅｉ，２０００，９７：１２９０８—１２９１３． ［５］ ＺＤＵＮＥＫ—ＺＡＳＴＯＣＫＡ Ｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒ－ ｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏ－ ｃｈｅｍ，２００８，４６：１９—２８． ［６］ＯＭＡＲＯＶ Ｒ Ｔ，ＤＲ￣ＧＥＲ Ｄ，ＴＩＳＣＨＮＥＲ Ｒ，ｅｔ ａ１．ＡＩ・ ｄｅｈｙｄｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｓｕｂｕｎｉｔ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｒｏｏｔｓ ｏｆ ｂａｒｌｅｙ ａｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ａｍｍｏｎｉｕｍａｎｄ ｎｉｔｒａｔｅ［Ｊ］．Ｐｈｙｓ’ ｉｏｌ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，２００３，１１７：３３７—３４２． ［７］ＺＤＵＮＥＫ—ＺＡＳＴＯＣＫＡ Ｅ，ＯＭＡＲＯＶ Ｒ Ｔ，ＫＯＳＨＩＢＡ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＡＯ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｉｎ ｐｅａ ｐｌａｎｔｓ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．）ｄｕｒｉｎｇ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｎａｄ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｔｒｅｓｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ， ２００４。５５：１３６１—１３６９． ｌ２６ 华南师范大学学报（自然科学版） ２０１ｌ卑 ＥＸＰＲＥＳＳＩｏＮ．ＰＵＲⅡ ＩＣＡＴＩｏＮ ＡＮＤ ＰｏＬＹＣＬｏＮＡＬ ＡＮＴｍｏＤＹ Ｉ．ＲＥＰＡＲＡＴＩｏＮ ｏＦ ＦＵｓＩｏＮ ＡｈＡＯ２ ＰＲｏＴＥＥＮ ＹＡＮＧ Ｌｉｘｉａ ｔ“，ＺＨＯＵ Ｗｅｎｌｉｎｇ２ ，ＳＯＮＧ Ｔａｏｐｉｎｇ ，ＰＥＮＧ Ｘｉｎｋａｉ ，ＨＵ Ｃｈａｏｈｕｉ （１．Ｃｈａｎｇｓｈａ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ＆Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ｏｎ Ｆｏｏｄ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓａｆｅｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１００１３，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｂｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＧｕａｎｇｚｈＯＨ ５１０６３１，Ｃｈｉｎａ； ３．Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｓｕｇａｒｃａｎｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０３１６，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｐｒｇｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＰＲＯＥＸ—Ｈｔａ—ＡｈＡ０２ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐＰＲＯＥＸ—Ｈｔａ—ＡｈＡＯ２ ｐｌａｓｍｉｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｉｇｈ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ Ｈｉｓ—ＡｈＡＯ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１．Ａｎ ａｎｔｉ—ＡｈＡＯ２ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｒａｂｂｉｔ ｗｉｔｈ Ｈｉｓ— ＡｈＡＯ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ｂｙ ａｆｉｆｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｏｐｈｏｒｒｅｓｉｓ．Ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ＡｈＡＯ２ ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆ－ ｉｃａｌｌｙ ｔｏ Ｈｉｓ—ＡｈＡ０２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｒａｃｈｉｓ ｈ￣ｐｏｇａｅａ Ｌ．；ＡｈＡＯ２；ｐＰＲＯＥＸＨＴａ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａｎｔｉｂｏｄｙ 【责任编辑成文】 （上接第１２２页） Ｅ ’ＦＥＣＴ ｏＦ ＰｏＴ ＣＵＬＴＩＶＡＴＩｏＮ ＵＮＤＥＲ ＦＲＥＳＨ ＷＡＴＥＲ ＣｏＮＤＩＴＩｏＮ ｏＮ ＴＨＥ ＥＣｏ— ＰＨＹＳＩｏＩｏＧＩＣＡＬ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ ｏＦ ＡＥＧ ＡＳ ＣＤＲ 『Ｃ【，ＬＡ 聊ＳＥＥＤＬＩＮＧＳ ＤＩＡＯ Ｊｕｎｍｉｎｇ’，ＣＨＥＮ Ｇｕｉｚｈｕ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｆｅｎｃｅ，Ｊｉａｙｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍｅｉｚｈｏｕ ５１４０１５，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｕｎ Ｙａｔ—Ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０２７５，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｓｉｎｇ ａｒｔｉｉｆｃｉａｌ ｓｅａ ｗａｔｅｒ（８ ｇ／ｋｇ）ａｓ ａ ｃｏｎｔｒｏｌ，ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｐｏｔ—ｃｕｌｔｉｖａｔｅ １一 ｙｅａｒ——ｏｌｄ ｍａｎｇｒｏｖｅ ｏｆ Ａｅｇｉｃｅｒａｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ ｆｏｒ ｏｎｅ ｙｅａｒ ｉｎ ｆｒｅｓｈ ｗａｔｅｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｕｈｉ－－ ｖａｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｆｒｅｓｈ ｗａｔｅｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｅｃｏ——ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ａｅｇｉｃｅｒａｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ，ｔｈｏｕｇｈ ｔｈｅｒｅ ｉｓ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｅｃｏ—ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓ— ｔｉｃｓ ｗｈｅｎ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，Ａｅｇｉｃｅｒａｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ ｃａｎ ｇｒｏｗ ｎｏｒｍａｌｌｙ ｕｎｄｅｒ ｆｒｅｓｈ ｗａｔｅｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ， ａｓ ｔｈｅ ｌ—ｙｅａｒ—ｏｌｄ Ａｅｇｉｃｅｒａｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ ｓｈｏｗｅｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｓｔｒｏｎｇ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｒｏｏｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ ｐｏｎｄ ｓｃｕｍ ｂｒａｎ：１：０ ａｎｄ ｐｏｎｄ ｓｃｕｍ ｂｒａｎ＝２：１ ｗｅｒｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｆｒｅｓｈ ｗａｔｅｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ． ｒｅｓｈ ｗａｔｅｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；ｅｃｏ—ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｅｇｉｃｅｒａｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ；ｐｏｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｕｎｄｅｒ ｆ．ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ 【责任编辑成文】