避免基因组DNA污染的半定量RT-PCR新方法

避免基因组DNA污染的半定量RT-PCR新方法

作者：卢加举 崔百明 廖文彬 于海川 彭明 来源：《天津农业科学》2011年第06期

摘要：为了消除基因组DNA的污染，在逆转录引物oligo-dT5’端加上通用引物T7B结合序列，根据3’-RACE的原理，用T7B和目标基因特异性引物即可进行半定量RT-PCR分析。用该方法对转GhGAI基因的拟南芥进行表达分析，结果表明：此方法可有效避免基因组DNA污染导致的假阳性。

关键词： 半定量RT-PCR；新方法；转基因植株

中图分类号：X171 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2011.06.002

A New Semiquantitative RT–PCR Technique to Avoid Genome DNA Contamination LU Jia-ju1，CUI Bai-ming2，LIAO Wen-bin 2，YU Hai-chuan 2，PENG Ming 2 (1.Guizhou Institute of Subtropical Crops, Xingyi, Guizhou 562400,China; 2.State Kay Laboratory of Tropical Crop Biotechnology, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou , Hainan 571101, China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ: In this paper, a new semi-quantitative reverse transcription PCR technique was employed for analyzing the expression of genes, which have no intron or unknown intron. To deal with the existence of genome DNA contamination, universal primer T7B link sequence was added to oligo-dT-5'end. The reverse transcription PCR was performed by using T7B and special primer of target according to 3 'RACE theory. The expression of GhGAI gene in transgenic Arabidopsis was analyzed using this method, the results indicated that this method could effectively remove genome DNA contamination and prevent against false-positive result.

Key words: semi-quantitative Reverse Transcription PCR;new technique;transgenic plants

检测和分析组织或细胞中的基因表达水平常用的方法有原位杂交[1-2]、Northern印迹杂交、RNA斑点杂交[3]、S1核酸酶和核酸酶A保护分析法等，这些方法除原位杂交比较敏感外[4]，其它的方法均需要较多的样品量，而逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction)[5]是将mRNA分子的cDNA序列进行扩增，从而为用非常少量的模

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板分析RNA表达提供了可能。现在RT-PCR以其灵敏度高(比杂交法高1 000～10 000倍)、专一性好、快速简单等特点，作为mRNA测定和定量日益得到大家的认可，已被广泛地用于基因工程中目的基因表达水平的检测[3]。当我们导入植物的基因无内含子或者内含子不详，那么对其表达量进行半定量RT-PCR分析时，就会出现基因组DNA的污染造成的假阳性现象。使用DNA酶消化基因组DNA可以避免DNA的污染，但是DNA酶消化过程会导致部分RNA的降解。笔者就如何有效避免RNA样品中基因组DNA污染的半定量RT-PCR新方法作一介绍：即根据3′-RACE的原理，在逆转录引物oligo-dT 5′端加上通用引物T7B结合序列，用T7B和目标基因特异性引物即可进行半定量RT-PCR分析,并避免基因组DNA污染。 1 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 转基因植株 转化棉花GhGAI（GenBank登录号：DQ006269）基因的T2代转基因拟南芥。

1.1.2 试剂 Plant RNA Purification Reagent购自Invitrogen公司；Quant Reveres Transcriptase 试剂盒、HotStart Taq DNA Ploymerase均购自天根生化科技有限公司。 1.2 方 法

1.2.1 引物设计 引物均利用Vector NTI软件设计。根据棉花GAI基因序列，合成GAIP1、GAIP2 和MGAIs等引物；3′-RACE起始引物T7dTN和互补引物T7B；以拟南芥Histone基因（GenBank登录号: AT4G40040）为内标，引物为MHIS3s和 MHIS3a (表1)。上述引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.2 叶片总RNA提取 按照Invitrogen公司的Plant RNA Purification Reagent试剂说明书提取拟南芥叶片总RNA，具体操作步骤如下：取100 mg拟南芥新鲜叶片，用液氮研磨成粉后，快速转入1.5 mL离心管中，加0.5 mL冰冷的RNA 提取试剂，迅速混匀；室温放置5 min，12 000 r·min-1 4 ℃离心2 min，取上清液，加入0.1 mL 5 mol·L-1 NaCl，混匀后加入0.3 mL氯仿充分混匀；12 000 r·min-14 ℃离心10 min，取上清液，加入等体积异丙醇混匀后，室温放置10 min；12 000 r·min-1 4 ℃ 离心10 min，弃上清液，加入1 mL 75％乙醇洗沉淀；12 000 r·min-1 室温离心1 min，弃尽上清液；干燥沉淀后溶于10～30 μL DEPC处理水，立即取1 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，-70 ℃保存备用。

1.2.3 RT-PCR 按Quant Reveres Transcriptase试剂盒说明书操作逆转录反应，其反应体系为：总RNA 1.5 μL，10×RT 缓冲液 2 μL，2.5 mmol·L-1 dNTPs 4 μL，10 μmol·L-1 T7dTN 2

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μL(或Oligo(dT)18 1 μL），10 U RNA酶抑制剂，Quant Reveres Transcriptase 逆转录酶1 μL，DEPC处理过的水补至反应总体积20 μL，轻微混匀后，37 ℃保温1 h。逆转录反应结束后，每个样品管加29.82 μmol·L-1的EDTA 1.2 μL，鳌和逆转录产物中的Mg2+，便于cDNA的长期保存，同时可减小多余的Mg2+对下一步PCR反应的影响，并加78.8 μL去离子水将逆转录产物稀释到100 μL，-20 ℃保存备用。取2 μL反转录产物为模板进行PCR扩增。扩增体系为：2 μL 10×Hot Start Taq 缓冲液(含MgCl2)，10 m mol·L-1 dNTPs 0.4 μL，5′和3′端引物各10 μmol·L-1，0.5 U Hot Start Taq DNA 聚合酶，反应总体积20 μL。

1.2.4 RT-PCR反应条件的优化 根据HotStart Taq DNA Ploymerase使用说明，以上述合成的cDNA为模板，优化模板量及循环次数做PCR，确定最适宜的参数，建立能同时稳定扩增GAI和HIS3基因片段的半定量RT-PCR检测体系。

1.2.5 PCR反应产物的检测 取5 μL PCR扩增产物，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果用高分辩数字图像分析系统FluorChem 5500 v4.0进行成像和光密度分析。 2 结果与分析

2.1 总RNA质量及引物特异性验证

测定RNA样品的纯度和完整性，结果显示ODA260/ODA280值约为2.0，电泳图谱条带清晰、28 s和18 s比值约为2，证明样品的总RNA质量较好（图1）。由图2可知，分别以总RNA、Oligo(dT)18为起始引物合成的cDNA为模板，GAIP1和GAIP2引物做PCR可以扩增出与预期大小一致的条带；而MGAIs和T7B引物只有用T7dTN为起始引物合成的cDNA作模板才能扩增出与预期大小一致的条带，而用RNA作为模板则没有相应条带。说明以T7dTN反转录合成的cDNA和用引物MGAIs和T7B做RT-PCR，即可有效避免基因组DNA的污染。

这是因为我们转化的GhGAI基因不含内含子，即使用Oligo(dT)18作反转录合成的cDNA，用GhGAI基因序列设计合成的GAIP1和GAIP2引物进行PCR，在提取的样品总RNA中含有微量的基因组DNA时，就能扩增出与目标条带一致的产物，很容易导致假阳性。可我们利用3′-RACE起始引物T7dTN反转录合成的cDNA，T7B互补引物和GhGAI基因同源引物MGAIs进行PCR扩增， 就可有效避免样品污染基因组DNA而造成的假阳性结果。

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2.2 半定量RT-PCR模板量的确定

根据内标Histone基因的PCRHistone基因扩增结果确定进行PCR反应时加入的cDNA量。首先每个样品取1 μL cDNA，用MHIS3s和MHIS3a引物进行PCR反应，结果用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的量。依据此轮PCR结果调整cDNA的量进行下一轮PCR，直到每个样品的PCR扩增Histone基因产物的量一致时，确定所需加入的cDNA量模板量，据此cDNA量PCR扩增GhGAI基因，检测每个样品中GhGAI基因的表达量。

2.3 半定量RT-PCR循环次数的确定

用T7dTN起始引物反转录合成的cDNA为模板，用MHIS3s/MHIS3a和MGAIs/T7B引物，分别设18，20，22，24，26，28，30个循环扩增Histone基因和GhGAI基因(图4)。结果经凝胶成像系统扫描分析，以各电泳条带的光密度值(光密度曲线峰面积)为纵坐标，循环次数为横坐标作图(图5)。如图5所示，Histone和GhGAI基因在设定的每个循环都可被检出，但在26，28和30个循环都进入平台期。因此，为保证扩增体系中目标片段的扩增均处于线性期[6-7]，故确定循环数为24。PCR 扩增条件为94 ℃预变性5 min后，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共24个循环。

3 结论与讨论

半定量RT-PCR检测体系必须有效去除RNA中基因组DNA污染造成的PCR反应中存在的假阳性结果[8]。本试验所转化的目的基因没有内含子，无法采用跨内含子的引物设计方法避免PCR反应中基因组DNA污染造成的假阳性结果[9]。如果用DNA酶消化基因组DNA，那么在操作的过程中又会导致RNA的降解，使最后结果不准确。因此，我们利用3′-RACE的原理，根据目标基因序列设计的特异引物和通用引物T7B进行PCR扩增，有效地避免了基因组DNA污染问题。

PCR扩增反应是酶促反应，遵循酶促反应定律，开始的循环内扩增产物呈指数累积，产物与模板量呈线性关系，半定量RT-PCR技术[1]正是利用产物与模板的这一线性关系，通过扩增产物来对比总RNA中目的基因的表达进行定量，该技术己被广泛成功应用于检测转基因植株中基因的表达[10]。但经过一定的循环后，PCR产物不再呈指数累积而进入平台期，因此，为避免平台效应的影响，确定最合适的循环数是半定量RT-PCR方法的关键因素之一。本试验中

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目的基因与内参基因的扩增动态曲线表明，二者处于线性期的最佳循环次数为24，但内参基因的PCR扩增效率较高，故采用在同等条件下异管扩增目的基因。

为避免RNA提取、cDNA合成及PCR反应过程中存在的系统误差和人为误差。本试验除选用在植物体内稳定表达的持家基因Histone作为内参，采用反转录与PCR分开进行的两步法RT-PCR，在试验摸索阶段较一步法RT-PCR更为经济、有效。为尽量避免RNA的降解，每次提取总RNA后，立即反转录成cDNA，而且每一次反转录合成的cDNA模板可供多次PCR使用，不但有效节约成本，还缩短了试验周期，提高了试验的成功率。此外，本试验不进行RNA定量，而对持家基因Histone亮度确定模板量，从而确定转基因植株中目的基因的相对表达量，提高PCR扩增的准确性。

总之，本试验方法不仅可以有效避免RT-PCR反应时，基因组DNA污染造成的假阳性，也为半定量RT-PCR中模板定量提供了参考依据。

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