doi:10.3969/j.issn.1000鄄484X.2019.19.010
微小RNA鄄600在卵巢癌组织的表达及其靶向调控对氧磷酶3对卵巢癌细胞株OVCAR鄄3侵袭和迁移的影响淤
李摇航摇杨摇蝶于摇刘慧芝摇(遵义医科大学附属医院医务处,遵义563003)
摇摇中图分类号摇R737郾31摇摇文献标志码摇A摇摇文章编号摇1000鄄484X(2019)19鄄2357鄄06
[摘摇要]摇目的:探讨微小RNA(miRNA)鄄600在卵巢癌组织及细胞系的表达及其靶向调控对氧磷酶3对卵巢癌细胞株OVCAR鄄3侵袭和迁移的机制。方法:收集2017年1月至2018年10月我院妇产科经手术治疗的卵巢癌患者共50例。使用Lipofectamine2000将miRNA鄄600模拟物、miRNA鄄600抑制剂、模拟物与抑制剂对照物、对氧磷酶3(PON3)及其对照载体等转染到卵巢癌细胞。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT鄄PCR)检测miRNA鄄600和PON3基因相对表达量。蛋白印迹检测法
0郾20;MMP鄄2:2郾04依0郾12;MMP鄄9:2郾39依0郾20;迁移率:(37郾63依3郾76)%;细胞侵袭数量:19郾34依4郾63]的miRNA鄄600与E鄄钙黏素显著增高,而N鄄钙黏素、MMP鄄2、MMP鄄9、迁移率和细胞侵袭数量显著降低(P<0郾05);与抑制剂对照[miRNA鄄600:2郾15依0郾19;N鄄钙黏素:1郾89依0郾22;E鄄钙黏素:4郾92依0郾42;MMP鄄2:1郾76依0郾09;MMP鄄9:1郾88依0郾12;迁移率:(41郾45依3郾97)%;细胞侵袭数量:41郾56依7郾98]相比,miRNA鄄600抑制剂[miRNA鄄600:0郾26依0郾08;N鄄钙黏素:4郾67依0郾60;E鄄钙黏素:1郾85依0郾07;MMP鄄2:4郾38依0郾57;MMP鄄9:4郾55依0郾60;迁移率:(84郾12依6郾50)%;细胞侵袭数量:62郾89依9郾57]的miRNA鄄600与E鄄钙黏素显著降低,而N鄄钙黏素、MMP鄄2、MMP鄄9、迁移率和细胞侵袭数量显著增高(P<0郾05)。与模拟物对照[迁移率:(46郾45依3郾88)%;细胞侵袭数量:49郾76依4郾26]相比,miRNA鄄600模拟物[迁移率:(22郾09依1郾68)%;细胞侵袭数量:26郾17依3郾40]的OVCAR鄄3细胞迁移率和细胞侵袭数量均显著降低(P<0郾05),PON3载体[迁移率:(92郾11依6郾05)%;细胞侵袭数量:77郾04依7郾64]的OVCAR鄄3细胞迁移率和细胞侵袭数量均显著增高(P<0郾05),而miRNA鄄600模拟物联合PON3载体[迁移率:(55郾09依4郾16)%;细胞侵袭数量:52郾36依5郾37]OVCAR鄄3细胞迁移率和细胞侵袭数量差异无统计学意义(P<0郾05)。与模拟物对照[结节重量:(2郾76依0郾22)g;结节数量:13郾45依2郾54]相比,miRNA鄄600模拟物[结节重量(0郾69依0郾08)g;结节数量:4郾19依0郾63]处理的裸鼠腹腔内肿瘤转移结节重量和数量均显著降低(P<0郾05)。免疫组织化学染色结果显示,与模拟物对照(9郾76依0郾91)相比,miRNA鄄600模拟物(1郾84依0郾16)处理的裸鼠结节中PON3的免疫组织化学评分显著降低(P<0郾05)。结论:miRNA鄄600可抑制卵巢癌OVCAR鄄3细胞迁移与侵袭能力,其机制与调控靶基因PON3密切相关。
[关键词]摇卵巢癌;微小RNA;迁移;侵袭;对氧磷酶3
(WB)检测PON3及侵袭和迁移相关分子E鄄钙黏素、N鄄钙黏素、MMP鄄2、MMP鄄9的蛋白分子水平。应用划痕试验和Transwell实验分别测定细胞迁移和侵袭能力。免疫组织化学法检测组织中PON3、E鄄钙黏素、N鄄钙黏素、MMP鄄2、MMP鄄9的水平。结果:与癌旁组织(6郾11依1郾15)相比,癌组织(3郾81依0郾69)中miRNA鄄600的相对表达量显著降低(t=7郾139,P<0郾05)。与模拟物对照[miRNA鄄600:2郾13依0郾18;N鄄钙黏素:4郾78依0郾69;E鄄钙黏素:2郾07依0郾24;MMP鄄2:5郾16依0郾73;MMP鄄9:4郾44依0郾62;迁移率:(73郾45依5郾18)%;细胞侵袭数量:47郾22依6郾90]相比,miRNA鄄600模拟物[miRNA鄄600:7郾88依0郾69;N鄄钙黏素:2郾21依0郾45;E鄄钙黏素:4郾67依
ExpressionofmicroRNA鄄600inovariancancertissuesanditstargetedregulationeffectofparaoxonase3oninvasionandmigrationofovariancancercelllineOVCAR鄄3
LIHang,YANGDie,LIUHui鄄Zhi郾DepartmentofMedicalServices,AffiliatedHospital,ZunyiMedicalUniversity,Zunyi563003,China
[Abstract]摇Objective:ToinvestigatetheexpressionofmicroRNA(miRNA)鄄600inovariancancertissuesandcelllinesandtoexplorethemechanismofparaoxonase3invasionandmigrationofovariancancercelllineOVCAR鄄3郾Methods:Atotalof50patients
withovariancancerwhounderwentsurgeryinourdepartmentfromJanuary2017toOctober2018wereenrolled郾miRNA鄄600mimics,miRNA鄄600inhibitor,mimicsandinhibitorcontrol,paraoxonase3(PON3)anditscontrolvectorweretransfectedintoovariancancercellsbyLipofectamine2000郾Quantitativereal鄄timepolymerasechainreaction(qRT鄄PCR)wasusedtodetecttherelativeexpressionofmiRNA鄄600andPON3genes郾WesternblotwasusedtodetecttheproteinlevelsofPON3andinvasionandmigrationrelatedmoleculesE鄄cadherin,N鄄cadherin,MMP鄄2andMMP鄄9郾Thecellmigrationandinvasionabilityweredeterminedbythescratchtestandthe
淤本文为贵州省教育厅计划项目[No郾KY(2017)045]。于遵义市第一人民医院血管超声诊断室,遵义563002。
作者简介:李摇航,男,硕士,讲师,主要从事器官捐献与移植/法医方面研究,E鄄mail:1261333060@qq郾com。
·2358·中国免疫学杂志2019年第35卷
Transwelltest,respectively郾ThelevelsofPON3,E鄄cadherin,N鄄cadherin,MMP鄄2,MMP鄄9intissuesweredetectedbyimmunohistochemistry郾Results:Comparedwithadjacenttissues(6郾11依1郾15),therelativeexpressionofmiRNA鄄600incancertissues(3郾81依0郾69)wassignificantlydecreased(t=7郾139,P<0郾05)郾Comparedwiththemimicscontrol[miRNA鄄600:2郾13依0郾18;N鄄cadherin:4郾78依0郾69;E鄄cadherin:2郾07依0郾24;MMP鄄2:5郾16依0郾73;MMP鄄9:4郾44依0郾62;mobility:(73郾45依5郾18)%;cellinvasionnumber:47郾22依6郾90),miRNA鄄600mimics(miRNA鄄600:7郾88依0郾69;N鄄cadherin:2郾21依0郾45;E鄄cadherin:4郾67依0郾20;MMP鄄2:2郾04依0郾12;MMP鄄9:2郾39依0郾20;mobility:(37郾63依3郾76)%;cellinvasionnumber:19郾34依4郾63]showedsignificantlyincreasedmiRNA鄄600andE鄄cadherin,whileN鄄cadherin,MMP鄄2,MMP鄄9,mobilityandcellinvasionweresignificantlyreduced(P<0郾05)郾Comparedwiththeinhibitorcontrol[miRNA鄄600:2郾15依0郾19;N鄄cadherin:1郾89依0郾22;E鄄cadherin:4郾92依0郾42;MMP鄄2:1郾76依0郾09;MMP鄄9:1郾88依0郾12;migration:(41郾45依3郾97)%;cellinvasionnumber:41郾56依7郾98],miRNA鄄600inhibitors[miRNA鄄600:0郾26依0郾08;N鄄cadherin:4郾67依0郾60;E鄄cadherin:1郾85依0郾07;MMP鄄2:4郾38依0郾57;MMP鄄9:4郾55依0郾60;mobility:(84郾12依6郾50%);cellinvasionnumber:62郾89依9郾57]showedsignificantlylowermiRNA鄄600andE鄄cadherin,whileN鄄cadherin,MMP鄄2,MMP鄄9,mobilityandcellinvasionweresignificantlyincreased(P<0郾05)郾Comparedwiththemimicscontrol[mobility:(46郾45依3郾88)%;cellinvasionnumber:49郾76依4郾26],thecellmigrationrateandcellinvasionnumberofmiRNA鄄600mimics[mobility:(22郾09依1郾68)%;cellinvasionnumber:26郾17依3郾40]weresignificantlydecreased(P<0郾05),andthecellmigrationrateandcellinvasionnumberofPON3vector(mobility:(92郾11依6郾05)%;cellinvasionnumber:77郾04依7郾64]weresignificantlyincreased(P<0郾05)郾TherewasnosignificantdifferenceincellmigrationrateandcellinvasionofmiRNA鄄600mimeticcombinedwithPON3vector[mobility:(55郾09依4郾16)%;cellinvasionnumber:52郾36依5郾37;P<0郾05]郾Comparedwiththemimicscontrol[noduleweight:(2郾76依0郾22)g;numberofnodules:13郾45依2郾54],theweightandnumberoftumormetastaticnodulesinthemiRNA鄄600mimic[nodularweight:(0郾69依0郾08)g;numberofnodules:4郾19依0郾63]treatednudemiceweresignificantlylower(P<0郾05)郾Immunohistochemicalstainingshowedthattheimmunohis鄄tochemicalscoreofPON3innudemicenodulestreatedwithmiRNA鄄600mimics(1郾84依0郾16)wassignificantlylowerthanthatofthemimicscontrol(9郾76依0郾91)(P<0郾05)郾Conclusion:MiRNA鄄600caninhibitthemigrationandinvasionofovariancancerOVCAR鄄3cells,anditsmechanismiscloselyrelatedtotheregulationoftargetgenePON3郾
[Keywords]摇Ovariancancer;MicroRNA;Migration;Invasion;Paraoxonase3
摇摇卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一[1]。尽管在过去数十年中卵巢癌的临床治疗策略有了显著改善,但其5年生存率仍较低,约为35%~38%[2]。至今,关于卵巢癌的潜在发展机制尚不完全清楚。因此,阐明卵巢癌发生和进展的具体机制对于临床开展新的诊疗方案至关重要。
微小RNA(microRNA,miRNA)是一类进化上高度保守的非编码RNA,通过与靶基因3忆非翻译区结合,在转录后水平调节靶基因的表达[3]。基于调控靶蛋白的功能,miRNA在肿瘤的多种生物学过程中发挥作用,包括有细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等,进而在肿瘤发生中扮演致癌或肿瘤抑制功能,并有望成为卵巢癌的潜在治疗靶标[4,5]。
miRNA鄄600是一种癌症相关miRNA,在胃癌、
10%胎牛血清购自美国HyClone公司;miRNA鄄600均购自广州复能基因有限公司;对氧磷酶3
中心;RPMI1640培养基购自美国Gibco鄄BRL公司;模拟物、miRNA鄄600抑制剂、模拟物与抑制剂对照物(Paraoxonase3,PON3)及其对照载体等均购自美国Sigma公司;Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司;TRIzol、miRNA逆转录试剂盒、miRNA测定试剂盒均购自武汉生之源生物科技股份有限公司;引物序列购自武汉天一辉远生物公司;Westernblot所用PON3、E鄄钙黏素、N鄄钙黏素、基质金属蛋白酶(Matrix
GAPDH一抗及二抗均购自美国Abcam公司;免疫
metalloproteinase,MMP)鄄2、MMP鄄9和
急性白血病等不同癌症中发挥抑癌作用[6,7]。然而,到目前为止,miRNA鄄600在卵巢癌的作用尚不清楚。因此,在本研究中,我们首先分析miRNA鄄600在卵巢癌及癌旁的表达情况,并分析其对卵巢癌侵袭和迁移中的影响及可能的机制。
9一抗和二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公1郾1郾2摇卵巢癌组织样本收集摇收集2017年1月至共50例,年龄46~68岁,平均(58郾7依7郾2)岁,获取品快速冷冻并储存在液氮中用于进一步研究。卵巢癌患者纳入与排除标准:淤排除已接受免疫疗法及化疗或放疗患者;于纳入患者须获得本人或直系家属知情同意并签署知情同意书;盂排除既往有其他恶性肿瘤史者。卵巢癌分期根据2018年国际妇产科联合会标准[8]。本次研究经院伦理委员会批准。司;雌性裸鼠购自吉林大学实验动物中心。
2018年10月我院妇产科经手术治疗的卵巢癌患者50对癌及癌旁组织(距离癌组织>3cm)。将组织样
组化所用PON3、E鄄钙黏素、N鄄钙黏素、MMP鄄2、MMP鄄
1摇材料与方法
1郾1摇材料1郾1郾1摇
试剂摇
卵巢癌细胞系SKOV3、A2780、
OVCAR鄄3、HO鄄8910和人卵巢表面上皮细胞系HOSEpiC均购自中国科学院上海生科院细胞资源
李摇航等摇微小RNA鄄600在卵巢癌组织的表达及其靶向调控对氧磷酶3对卵巢癌细胞株OVCAR鄄3侵袭和迁移的影响摇第19期·2359·
1郾2摇方法1郾2郾1摇
10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI1640培1郾2郾2摇
养基中生长,培养在37益,5%CO2培养箱。miRNA鄄600模拟物、miRNA鄄600抑制剂、模拟物与抑制剂对照物、PON3及其对照载体等转染到卵巢癌细胞。reversetranscription鄄PCR,qRT鄄PCR)摇应用TRIzol
细胞转染摇使用Lipofectamine2000将
OVCAR鄄3、HO鄄8910和HOSEpiC细胞系均在含有
细胞系与细胞培养摇SKOV3、A2780、
的细胞30min,经0郾1%结晶紫染色10min。用倒置光学显微镜以200伊放大倍数视野中拍摄细胞,并1郾2郾6摇免疫组织化学染色摇将石蜡切片(约4滋m厚度)进行脱蜡并通过二甲苯和梯度乙醇再水合,放置于3%过氧化氢一起温育10min以淬灭内源性1h,并与PON3、E鄄钙黏素、N鄄钙黏素、MMP鄄2、MMP鄄9单克隆抗体一起温育,4益过夜。碱性磷酸酶二抗室温孵育1h。最后,用二氨基联苯胺染色切片,然过氧化物酶活性。然后,在室温下用山羊血清封闭在5个随机视野中计算细胞数量。
1郾2郾3摇实时定量逆转录PCR(Real鄄timequantitative
法提取卵巢癌组织样品和卵巢癌细胞中总RNA。使用miRNA逆转录试剂盒和miRNA测定试剂盒进600行qRT鄄PCR和PON3测定的内参。U6。和引GAPDH物序列如分别作为下,miRNA鄄600miRNA鄄正CGGCCCTTAACTCATTCTTT鄄3忆;向:5忆鄄CTGTGTGCCACACAGTTTG鄄3忆,TCGGCAGCACATATAC鄄3忆,U6正向:反向:5忆鄄GCTAATCTT鄄3忆;GGGGTC鄄3忆;反向PON3:5忆鄄CGAGAAACTCCTGCTTGGGG鄄
正向反向:5忆鄄CTCGGCAGTGTGT鄄:5忆鄄CAGGGGCCAT鄄5忆鄄CGCT鄄3忆;GAPDHTGA鄄3忆;CA鄄3忆。本重复检测应用反正向向:5忆鄄ATTCCATGGCACCGTCAAGGC鄄32:-驻CT5忆鄄TTCTCCATGGTGGTGAAGACGC鄄法进行相对表达量计算,每个样1郾2郾4摇Western次。
blot摇使用RIPA裂解缓冲液提取细胞蛋白,并使用BCA试剂盒测量蛋白质浓度。在浓度为10%的SDS凝胶上加载并分离蛋白后,将细胞蛋白质转移到PVDF膜上。将膜与PON3、E鄄钙黏素、N鄄钙黏素、MMP鄄2、MMP鄄9和GAPDH一抗4益孵育过夜。将对应二抗与PVDF膜在室温下孵育2h。1郾使用2郾5摇ECL细胞迁移和侵袭测定试剂检测目的蛋白质的表达水平摇为了确定卵巢癌细。胞的迁移能力,通过将相应转染处理的细胞(1伊105个/孔)加至6孔板中进行划痕试验测定。随后,用无菌塑料微量移液管尖端在细胞单层中创建一个均匀的划痕。用PBS洗涤细胞并在37益,5%CO件下培养24h。然后,用倒置相差显微镜在划痕后2条0量划痕后两条细胞边缘之间的垂直距离h和24h对细胞进行成像。采用Image,计算细胞J软件测24痕间距h迁移率)/0h,迁移率划痕间距(%伊100%)=(0。
h划痕间距-24h划使用Transwell实验测定细胞侵袭能力。将无血清培养基中的2伊105个细胞接种到涂有基质胶的上室中。在下室中加入含有10%FBS的RPMI1640培养基作为化学引诱剂。24h后,用棉签轻轻除去上室中非侵入细胞,并用70%乙醇固定侵入基质胶后苏木精染色。应用ImageProPlus对免疫组化结果进行分析,并按阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱评分。免疫组织化学评分=a伊b,a代表阳性细1%胞百分~10%比(;aa==2,0,阳性细胞为无阳性细胞11%;a=~1,50%阳性;a细=3,胞阳为81%性细胞为51%~80%,a=4阳性细胞所占比例达b=1,以上弱阳性),b;b代表阳性细胞染色强弱=2,中度阳性;b=3,强阳性(b=)。0,阴性;1郾6002郾荧光素酶报告基因测定是否与7摇荧光素酶报告基因测定PON3的3忆非翻译区相互作用摇为研究。将PON3的3忆非翻译区序,miRNA鄄进行了列或突miRNA鄄600变序列克隆到pMIR鄄REPORT载体中pRL鄄SV40荧光素酶活性水平一起转染到卵巢癌细胞中模拟物或相应的对照与。
。报48告h质后测定粒。将和1郾2郾8摇裸鼠体内实验摇对于肿瘤转移实验,将经转染处理的约2伊106个细胞于腹膜内注射至6~8周龄的雌性裸鼠中。3周后处死小鼠并计数腹膜内肿瘤结节。收获每只小鼠的结节用于qRT鄄PCR和免1郾疫组织化学染色Prism3摇
统计学分。
析摇应用SPSS20郾0和GraphPad的比较采用5郾0软件进行统计分析与图标制作字2检验。计量资料以x依s表示。,组间率多组和两组间比较分别采用F检验和t检验。P<0郾05为差异有统计学意义。
2摇结果
2郾1摇miRNA鄄600在卵巢癌组织及细胞系的表达情况摇与癌旁组织相比,癌组织中miRNA鄄600的相对表达7郾转移的卵巢癌患者组织中139,量P显<0郾著05),降低见图(6郾111A。依1郾且15miRNA鄄600芋vs~郁3郾和发生淋巴结81依0郾69,t=水平显著低1。于玉与~HOSEpiC域和未发生淋巴结转移者(8郾13依0郾52)相比(,PSKOV3<0郾05),(4郾见表
0郾11)、A2780(3郾87依0郾35)、OVCAR鄄3(2郾18依0郾17)、06依·2360·图1摇卵巢癌组织及细胞系中miRNA鄄600的表达水平Fig.1摇ExpressionlevelsofmiRNA鄄600inovariancancer
tissuesandcelllines
Note:*郾P<0郾05郾
表1摇miRNA鄄600表达水平与卵巢癌临床病理学特征之间
的关联
Tab.1摇AssociationbetweenmiRNA鄄600expressionlevels
andclinicalpathologicalfeaturesofovariancancer
Clinicalpathological
Relativex依s
expressionoft
miRNA鄄600
P
Age(year)features
n
Tumor臆60>60233郾1郾239
0郾407
273郾95依0郾69依0郾7063>5cm
size37133郾1郾0970郾762
臆5Stagingcm3郾87依0郾64依0郾6567玉-域35154郾5郾1940郾003
Lymphnode芋-郁2郾19依0郾93依0郾7546Yesmetastasis12-6郾3970郾001
No38
2郾4郾73依0郾15依0郾5274
HO鄄8910(3郾均显0郾05),著且在降低04依0郾(OVCAR鄄3t=8郾42)225、中细胞中降低最为显著8郾miRNA鄄600470、11郾013、的相对表达量9郾264,P<择OVCAR鄄3过表达进行后续实验miRNA鄄600可抑制,见图1B。
,故选2郾2摇OVCAR鄄3细胞侵袭与转移N鄄钙黏素:4郾摇与模拟物对照78依0郾69;E鄄钙黏素[miRNA鄄600:2郾13依0郾18;5郾16依0郾73;MMP鄄9:4郾44依0郾62;:2郾迁07依0郾移率24;MMP鄄2:5郾miRNA鄄60018)%;细:(73郾45依素:2郾21依0郾45;E鄄模拟物胞侵钙黏素[miRNA鄄600:7郾袭数量:47郾22:4郾67依0郾20;MMP鄄2:2郾88依0郾依6郾9069;N鄄]相钙黏比,0郾12;MMP鄄9:2郾39依0郾20;迁移率:(37郾6304依依3郾MMP鄄9、60076)%与E鄄;迁钙细胞侵袭数量移黏率素显著增:19郾高,而34N鄄依4郾钙63]黏素的、MMP鄄2、
miRNA鄄0郾钙黏素05);:1郾与抑制剂对照和细胞89依0郾22;E鄄[钙黏素miRNA鄄600:2郾侵袭数量显著降低(P<92依0郾1542;MMP鄄2:
依0郾19;N鄄1郾76依0郾09;MMP鄄9:1郾88依0郾12;:4郾迁移率:(41郾45依中国免疫学杂志2019年第35卷
图2摇miRNA鄄600抑制OVCAR鄄3细胞的侵袭与转移Fig.2摇
miRNA鄄600inhibitsinvasionandmetastasisofOVCAR鄄3cells
Note:A郾MMP鄄2,MMP鄄9miRNA鄄600transfectioneffect;B郾E鄄cadherin,N鄄cadherin,
D郾F郾CellCellinvasionmigrationproteinabilityabilitylevelsbetweenbetweenindifferentdifferentdifferenttransfectiontransfectiontransfectiongroups;C,groups郾
groups;E,3郾60097)%;细胞侵袭数量:41郾56依7郾98]相比,miRNA鄄
0郾MMP鄄9:4郾60;抑制剂E鄄钙[miRNA鄄600:0郾袭数量:62郾55依0郾黏素89依9郾60;:1郾57]迁移率85依0郾26依0郾08;N鄄钙黏素:4郾67依
的miRNA鄄600:(84郾07;MMP鄄2:12依6郾与50)%4郾38依E鄄钙黏素显著;细胞侵0郾57;降低,而N鄄钙黏素、MMP鄄2、MMP鄄9、迁移率和细胞侵袭数量显著增高2郾3摇PON3介导(PmiRNA鄄600<0郾05),见图对2。OVCAR鄄3细胞侵袭与转miRNA鄄600移功能的影响摇
TargetScan预测PON3是
基因检测中也得以验证的靶基因,且该结果在双荧光素酶报告(1郾PON3mRNA:6郾62依,0郾见图73;3A、B。PON3蛋与模拟物对照白:14郾36依0郾47)白水平均显著降低26;PON3相比,miRNA鄄600蛋白:2郾mRNA:5郾96依0郾94;PON3(65P<0郾依0郾模拟物05),29)的(PON3mRNA:2郾22依蛋白与抑制剂对照PON3mRNA:10郾13(PON3与蛋miRNA鄄600抑制剂(PON3mRNA:8郾98依1郾依1郾34)54;PON3相比,蛋白:18郾76依1郾98)的PON3mRNA与蛋白水平均显
著增高(P<0郾05),见图3C、F。
与模拟物对照[迁移率:(46郾45依3郾88)%;细胞侵袭数[迁移率量:(22郾:49郾09依1郾76依4郾68)%26]相;比细胞侵袭数量,miRNA鄄600:26郾模拟17依物李摇航等摇微小RNA鄄600在卵巢癌组织的表达及其靶向调控对氧磷酶3对卵巢癌细胞株OVCAR鄄3侵袭和迁移的影响摇第19期·2361·
图3摇PON3与miRNA鄄600的靶向关系验证
Fig.3摇PON3andmiRNA鄄600targetingrelationshipveri鄄
fication
Note:A郾reporterTargetScanexpressiongeneOVCAR鄄3oftestpredictscellsPON3results;C郾miRNA鄄600bydown鄄regulatingmRNA;miRNA鄄600targetD郾miRNA鄄600targetsgene;B郾Dualluciferase
PON3;E郾inhibitsandregulatesmiRNA鄄600migrationtheinhibits
ofOVCAR鄄3targetsandcellregulatesinvasionthebyexpressiondown鄄regulatingofPON3PON3;F郾protein郾*.miRNA鄄600P<0郾05.图4摇miRNA鄄600可抑制裸鼠卵巢癌细胞的转移及PON3
表达Fig.4摇
miRNA鄄600inhibitsmetastasisandPON3expressioninovariancancercellsinnudemice
3郾显著降低40]的OVCAR鄄36郾(P<0郾05),PON3细胞迁移率和细胞侵袭数量均载体[迁移率:(92郾11细胞迁移率和细胞侵袭数量均显著增高05)%;细胞侵袭数量:77郾04依7郾64]的依(POVCAR鄄3
<0郾05),
而(55郾miRNA鄄600OVCAR鄄309依4郾16)%模拟;细物胞联侵合袭PON3数量:载52郾体36[迁依5郾移37率]:学意义4摇过表达(P>0郾细胞迁移率和细胞侵袭数量差异无统计2郾miRNA鄄60005),见图3D、E。
可抑制裸鼠卵巢癌细胞的转移摇与模拟物对照[结节重量:(2郾76依0郾22)g;结节数量[:(13郾45依2郾54)]相比,miRNA鄄600模拟物处理的裸鼠腹腔内肿瘤转移结节重量和数量均显著结节重量:(0郾69依0郾08)g;结节数量:4郾19依0郾63]降低(P<0郾05)。免疫组织化学染色结果显示,与模拟物(1郾对照(9郾76依0郾91)相比,miRNA鄄600模拟评分显著降低84依0郾16)处理的裸鼠结节中物(P<0郾05)。
PON3的免疫组化3摇讨论
前期多篇报道指出miRNA在卵巢癌进展中起着
至关miRNA鄄600重要的细胞系中miRNA鄄600在卵巢癌中的作用作用[4,5]。在本研分别比正常卵巢组织和细胞系,发现在卵巢癌组织和
究中,我们探讨了显著下调。此外,芋~郁和发生淋巴结转移的卵巢癌患者组织中miRNA鄄600水平显著低于玉~域和未发生淋巴结转移者。miRNA鄄600可通过下调PON3表达9促进E鄄钙黏素表达,并下调N鄄钙黏素、MMP鄄2、MMP鄄
低异种移植裸鼠腹腔肿瘤转移的数量和肿瘤大小表达,进而抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭,并可降的两个重要分子标志物E鄄钙黏素和N鄄钙黏素是评估肿瘤细胞迁移能力。
,E鄄钙黏素是转移抑制分子,其水平增高将降低癌细胞的迁移能力[9]与E鄄钙黏素功能相反;N鄄钙黏素则细胞的迁移[10]。MMP鄄2,其水平增高则会显著促进癌酶家族的重要成员,两者增高会促进肿瘤细胞的侵袭和MMP鄄9是基质金属蛋白能力[11]并抑制。N鄄本实验发现钙黏,miRNA鄄600能促进E鄄钙黏素,
miRNA鄄600素、MMP鄄2和MMP鄄9表达,提在多种肿瘤中过表达PON3是分子量约为具有抑制卵巢癌细胞迁移与侵袭的功能示,并可通过在癌细胞中螯合泛
40kD的糖蛋白,已被发现
。
半醌结构而减少肿瘤细胞线粒体中超氧化物的形成,进而提高肿瘤细胞的抗氧化能力。本研究通过TargetScan软件预测,促进其迁移与侵袭[12]的3忆非翻译区miRNA鄄从而抑制600可直接靶向作用于PON3mRNA和蛋白表达水平PON3mRNA。
,
综上所述,miRNA鄄600可抑制卵巢癌OVCAR鄄3细胞迁移与侵袭能力,其机制与调控靶基因PON3密切相关。
(下转第2368页)
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