・－－－——８４４・－－－—— Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉ卿，Ｊｕｌｖ，２００８，ＶｏＩ１２，Ｎｏ．７ 细胞保藏库），ＤＭＥＭ、胰蛋白酶、新生胎牛血清购自 １．２．４转染ＳＫＯＶ３细胞实验分组①ｐａｒｅｎｔａｌ组； ＧＩＢＣＯ公司；ｒｉｆｔｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）；ＲＴ—ＰＣＲ ②无关ＲＮＡ组；③ｓｈＲＮＡ ａ组；④ｓｈＲＮＡ ｂ组；⑤ （Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）；Ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ合成（大连宝生物）（ＰＡＧＥ ｓｈＲＮＡ Ｃ组每组设３复孑Ｌ。 级）；体外转录试剂盒：Ｍｅｓｓａｇｅ ＭｕｔｅｒＭＴ ｓｈＲＮＡ Ｐｒｏ— 转染前一日，接种ＳＫ—ＯＶ３于２４孑Ｌ板中（１—２ Ｘ ｄｕｅｆｉｏｎ ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，ＵＳＡ）；转染试剂：ｓｉＰＯＲＴ Ａｍｉｎｅ ｌＯ４ ｃｅｌｌｓ／孑Ｌ），加５００ ｔ４培养基正常培养。转染时， （Ａｍｂｉｏｎ）；ＣＣＫ一８ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ一８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｊａｐａｎ）； 将１ ｇ ｓｈＲＮＡ稀释于培养基，终体积为１００ ，摇 无关ＲＮＡ（Ｑｉｇａｅｎ公司），卡铂（齐鲁制药）。 匀，再加入６ ｔ４ ｓｉＰＯＲＴ Ａｍｉｎｅ转染试剂，上下翻转混 １．２方法 合５次。将样品于室温下（１５℃一２Ｏ℃）孵育ｌＯ—ｌ５ １．２．１细胞培养传代培养时应用０．２５％胰蛋白酶 ｍｉｎ，形成转染复合物。在转染复合物形成过程中， 一Ｏ．５％ＥＤＴＡ混合液消化，并按１：３比率传代（浓度 轻轻吸出孔板中培养基，加入３００ 新培养基（含 为２ Ｘ ｌＯ５个／ｍ１），细胞培养液为含２０％小牛血清的 １０％胎牛血清）。加入转染复合物，轻轻旋动孑Ｌ板以 ＤＭＥＭ，并用同代细胞设立正常对照组与阴性对照。 使液体在细胞上平均分配后常规培养。 １．２．２ ｓｈＲＮＡｓ的设计 Ｎｃｂｉ检索全序列；去除序 １．２．５ ＲＮＡｉ结果检测（ＣＣＫ一８） （１）ＳＫ—ＯＶ３标准 号导入ｓｉＲＮＡ—ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ查找合适序列后ＢＬＡＳＴ； 生长曲线：材料：９６孑Ｌ板（ＢＤ公司，ＵＳＡ）；Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ— ＢＬＡＳＴ后共获得１４６条相关链，经过仔细推敲选取 ｉｎｇ ｔ一８（Ｄｏｊｉｎｄｏ公司，Ｊａｐａｎ）方法：①消化ＳＫ—ＯＶ３ 了基因碱基分布比较合理的的９，２１，４３，７０，７５号单 细胞，计数。②接种：分别以５ Ｘ １０ ０００ Ｃｅｌｌｓ，２．５ Ｘ 链。经过基因序列合理性比较，选取其中３条。设 １０ ０００ Ｃｅｌｌｓ，２Ｘ １０ ０００ Ｃｅｌｌｓ，１．５ Ｘ １０ ０００ Ｃｅｌｌｓ，１ Ｘ １０ 计含靶序列、Ｉ１７一启动子Ｉ及上下游额外８个可以帮 ０００ Ｃｅｌｌｓ，０．５ Ｘ １０ ０００ Ｃｅｌｌｓ种于９６孑Ｌ板。③每孑Ｌ加 助提高Ｔ７一ＲＮＡ聚合酶结合效率的核苷酸序列 １Ｏ ｌ ＣＣＫ一８（１：１０）④在ＣＯ２孵箱中孵育孑Ｌ板１—４ （ＴＡＴＡＧＴＧＡ）；上述Ｏｌｉｇｏ—ＤＮＡ交大连宝生物合成。 ｈ。⑤用小平板计数器测４５０ ｎｌｎ下的吸光度。⑥转 １．２．３体外转录法合成ｓｈＲＮＡ将公司合成的上 染：加样：９６孑Ｌ板，每孑Ｌ加ｓｉＲＮＡ ０．０７５ ｇ绘制标准 述Ｏｌｉｇｏ—ＤＮＡ，按体外转录方法经过退火杂交、 曲线。（２）与化疗药比较材料：卡铂（浓度８００ Ｋｌｅｎｏｗ酶切、自发转录形成如下短发夹即ｓｈｏｒｔ—ｈａｉｒ： Ⅱｌｌ，以５％葡萄糖稀释）方法：同前。 ｐｉｎＲＮＡ（发夹序列由Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ提供），示意图以ｂ序 ２结果 列为例如图１： ２．１ ｓｈＲＮＡｓ的设计 ＳｅｑｕｅｎＤｅ Ａ：５ ＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＣＴ ３ ５ Ｊ帕６Ｔ ３ Ａ＿ ｌｉ ｇｏ＿ｌ ３ ｒ ‘ｒＤｃ＾５ Ａ．＿Ｏｌｉｇｏ＿＿２ Ｓｅｑｕｅｎ腭Ｂ：５ ＡＣＡＴＣＴＦＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＣＺ３：Ｇ３ ５ ｒ ＾ｌＴＧＴＴＴ ３ 耻Ｄ ｌｉｇｏ＿ｌ ０ ｒ Ｉ￣＃４ＡＡ ５ Ｂ－ ｌｉｇｏ＿２ ５ ｒ＾舶＾ＴＧ。ｃＴＴＧ＾＾Ｇ＾ＴＧＴ ＴｃＧ ３ Ｂ—９ｉ ｉｇｏ＿３ ３ ｒ Ｔ ＴＣ＾Ｊ ＧＧＴ１’ＣＴＴＧＴ０Ｇ＾＾Ｇ＾ＴＧＴ ５ Ｂ—９ｌｉｇｏ．＿４ Ｓｅｑｕｍｕ￣Ｃ：５ ＡＧＡＴＣＡＣＡ￣ＴＦＡＣＣＴＡＴＣＴＦ ３ ５ ＾］ｒ（：Ｔ ０ ｃ＿ Ｉｉｇｏ＿ｌ ３ ｒ Ｔ＾６＾ ５ ｃ＿ ｉｉｇｏ．＿２ ５ ３ ｃ＿ ｌｉｇｏ ３ ３ ｒ ５ ｃ＿ ｌｉｇｏ．＿４ ２．２体外转录法合成的ｓｈＲＮＡ（图１） ２．３ ＲＮＡｉ结果分析ＣＣＫ－８细胞生长抑制情况测定 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国实验诊断学２００８年７月第１２卷第７期 笛 ＾｜１０∞ 《 ２ ・‘———８４５・－——— Ｔ Ｔ 而ｓｉＲＮＡｃ与对照组无明显差异。其中，ｓｉＲＮＡｂ在２ ｌ ５ ０ ５ ２ ｌ ０ ５ ＡＣＡ ＵＣ ＡＧ垒 ！ＪＧ ｃ Ｇ ｄ的抑制作用最强。从整个时间段来看，ｓｉＲＮＡｂ的 抑制作用最明显，而ｓｉＲＮＡａ和ｓｉＲＮＡｃ的抑制作用 ＵＧＵ ＡＧＡ ＡＧＧ ＵＧＵ ＵＣＵ ＵＧＧ ＡＣＣ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ 不明显，但ｓｉＲＮＡａ抑制作用强于ｓｉＲＮＡｃ。 图１ ｓｈＲＮＡｂ链示意图 ａ．标准曲线绘制用以证明ＳＫＯＶ３细胞是呈现 对数生长，可以正常进行后续试验。ＣＣＫ．８试剂盒 可正确显色，并且能按照近似直线回归的方式进行 显示（曲线略）。 ｂ．干涉后曲线（见图２） 图２经ｓｉＲＮＡ干涉后不同时间内的抑制曲线 如图２所示，经ｓｉＲＮＡ干涉后，各组在不同时间 点对细胞生长抑制曲线可见：在１ ｄ ｓｉＲＮＡｂ与卡铂 的抑制作用相仿，而ｓｉＲＮＡａ也有一定的抑制作用， 而ｓｉＲＮＡｃ与对照组无明显差异。其中，ｓｉ 在２ ｄ的抑制作用最强。从整个时间段来看，ｓｉＲＮＡｂ的 抑制作用最明显，而ｓｉＲＮＡａ和ｓｉＲＮＡｃ的抑制作用 不明显，但ｓｉＲＮＡａ抑制作用强于ｓｉＲＮＡｃ。 ２．３ ＣＣＫ．８细胞生长抑制情况测定（加入卡铂） — ｃｏｎｔｒｏｌ —－一ｓｉＲＮＡａ 十ｓｉＲＮＡｂ — 一ｓｉＲＮＡｃ 一卡铂 图３经ｓｉＲＮＡ干涉及加入卡铂后不同时间内的抑制曲线 如图３所示，经ｓｉＲＮＡ干涉后，各组在不同时间 点对细胞生长抑制曲线可见：在１ ｄ ｓｉＲＮＡｂ与卡铂 的抑制作用相仿，而ｓｉＲＮＡａ也有一定的抑制作用， 卡铂 图４ ｓｈＲＮＡｂ＋卡铂使细胞生长得到明显抑制 如图４所示：以卡铂与本实验抑制率最明显的 ＳｉＲＮＡｂ链联合应用，使细胞生长得到明显抑制，说 明ｅｒｂＢ２在卵巢癌耐药和预后不良中起重要作用。 ３讨论 ＲＮＡ干涉现象（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡｉ）是近十 年来基因组功能研究中最惊奇的发现。ＲＮＡｉ现已 迅速成为分析研究真核细胞基因功能的重要手段之 一，并且有望发展成为治疗性基因干涉［¨。 ＲＮＡｉ作用机制：外源性（如病毒）或内源性的 ｄｓＲＮＡ在细胞内与一种ＲＮＡ酶Ｉｌｌ—Ｄｉｃｅｒ结合，随即 被切割成２１．２３ｎｔ的，带有３ 端单链尾巴及磷酸化的 ５ 端的２１．２３ｎｔ的短链ｄｓＲＮＡ，是ＲＮＡｉ的起始诱导 物，即ｓｉＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ与Ｄｉｃｅｒ形成ＲＩＳＣ复合体。ｓｉＲ． ＮＡ作为引导序列，按照碱基互补原则识别靶基因转 录出的ｍＲＮＡ，并引导ＲＩＳＣ复合体结合ｍＲＮＡ，随后 ｓｉＲＮＡ与ｍＲＮＡ在复合体中换位，核酸酶Ｄｉｃｅｒ将 ｍＲＮＡ切割成２２．２３ｎｔ的片段，特异性地抑制靶基因 的表达，而新产生的双链ＲＮＡ片段可再次形成ＲＩＳＣ 复合体，继续降解ｍＲＮＡ，从而产生级联放大效应。 因此，每个细胞只需要几个ｓｉＲＮＡ分子就能够引起 强烈的ＲＮＡｉ效应。此外，ｓｉＲＮＡ还可以在ＲＮＡ依 赖性ＲＮＡ聚合酶的作用下进行大量扩增，并转运出 细胞，使ＲＮＡｉ扩散到整个机体并可以传代［ Ｉ３］。 ｓｉＲＮＡ合成：我们应用的是阳离子脂质体载体。 研究表明，在体外构建ｓｉＲＮＡ表达载体，通过启动子 诱导表达，在细胞内产生ｓｉＲＮＡ，触发ＲＮＡｉ，是一个 切实可行的方案。合成ｓｉＲＮＡ的一般原则是：① ｍＲＮＡ编码区选择２１个或２３个碱基序列，序列中 维普资讯 http://www.cqvip.com ・－———８４６・－——— Ｃｂｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉ８ ，Ｊｕｌｙ，２０ｏ８，Ｖｏｌ １２，Ｎｏ．７ ＧＣ含量比值尽可能接近５０％，理想的ＧＣ含量比值 序列过量增殖、对生物体的发育和基因表达调控起 为４５％一５５％，上限６０％，超过７０％作用明显减弱。 着重要的作用；另一方面也使得ＲＮＡ干涉技术在基 ５０一ｌＯＯｎｔ的ＡＵＧ启动子和终止子应该避免。②在一 因功能的研究方面具有广阔的前景，是进行大规模 排序列中避免出现３个以上鸟嘌呤。Ｐｏｌｙ Ｇ序列可 基因功能研究的有效的反向遗传分析工具。 以重叠，形成环状结构，严重影响ｓｉＲＮＡ的作用效 体外转录实验结果：ＳＫ－ＯＶ３细胞转染ｓｈＲＮＡ 果。③优先选择从起始序列。如果选择从起始， 后结果：正常对照组及无关ＲＮＡ组２４、４８、７２小时 对应的ｓｉＲＮＡ ３ 端碱基突出可以为ｄＴｄＴ，从ＲＮＡ合 可见细胞生长正常，与时相无关，着色为深棕色； 成的角度讲，可以大大降低ＲＮＡ合成成本和增加 ｓｉＲＮＡ（ａ）２４、４８、７２ ｈ可见有一定抑制效果，但４８小 ｓｉＲＮＡ对核苷酸酶的抵抗性。确保所选序列与其他 时即开始恢复生长，至７２小时恢复正常生长；ｓｉＲＮＡ 基因序列没有同源性ｌ４－７］。 （ｂ）２４、４８、７２ ｈ可见有明显抑制效果，以２４—４８小 众多的研究表明Ｃ—ｅｒｂＢ２基因与卵巢癌密切相 时最为明显，至７２小时仍维持相当抑制率，细胞着 关并影响预后，本实验希望应用ｓｉＲＮＡ有效干涉卵 色为浅棕色；ｓｉＲＮＡ（Ｃ）２４、４８、７２小时可见细胞生长 巢癌ＳＫＯＶ３细胞中Ｃ—ｅｒｂＢ２基因的表达。根据Ｃ— 正常，程度较对照组梢弱，着色为棕色，无抑制效果。 ｅｒｂＢ２基因外显子序列设计了含有１７一启动子的０ｌｉ— 半定量的ＲＴ－ＰＣＲ结果及ＣＣＫ－８实验结果：与组化 ｇｏ－ＤＮＡ模板，体外转录合成了３对ｓｉＲＮＡ，同时应用 完全吻合。 公司设计的发夹序列合成了发夹ＲＮＡ。ｓｈＲＮＡ设计 综上，利用Ｔ７一ＲＮＡ聚合酶体外转录合成ｓｉＲＮＡ 获取及使用价格适中，可以获得稳定整和的细胞系， 是简便有效的新方法，相比化学合成法具有技术简 做到了转染及检测方法多样化，而且可以用于体外 单价格低廉的优势，该方法可以经济有效地替代化 研究而不局限于细胞培养；发夹ＲＮＡ被引导并进入 学合成法。并为筛选有效ｓｉＲＮＡ序列，在整个基因 基因组ＤＮＡ的机制还不清楚。由于ＲＮＡ酶的广泛 组中进行大规模ＲＮＡ干涉研究铺平了道路。 存在与难以灭活的顽固特性，使得ＲＮＡ实验操作要 关闭或者抑制特异性基因表达对于改善化疗效 求较严格，为了保证成功进行的ＲＮＡ干涉实验，首 果是至关重要的。 先应注意一些操作事项。ＲＮＡ工作的主要问题是 参考文献： 防止ＲＮＡ酶的污染。ＲＮＡ酶无处不在，因此，严格 ［１］Ｇｉｌｍｏｕｒ Ｉ｜Ｍ，Ｍａｃｌｅｏｄ ＫＧ，ＭｃＣａｉｇ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｒｂＢ４／ＨＥＲ－４ 控制实验条件，避免任何可能的污染是保证实验成 ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃ，，ｎｃｅｒ［Ｊ］．ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００１，６１ （５）：２１６９． 功的关键。 ［２］Ｍｕｔｏ Ｍ Ｇ，Ｋａｓｓｉｓ Ａ Ｉ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＲＮＡｉ技术有着无可比拟的优势：①特异性。 ｔｒｅｌｍｅｎｔ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ｃａｎｃｅｉ＂，１９９５，７６（１Ｏｓｕｐｐ１）： ＲＮＡ干涉能够非常特异地只降解与之序列相应的 ２Ｏ１６． 内源基因的ｒｎＲＮＡ，根据不同目的基因结构序列合 ［３］］￣ｕｋｕｓｈｉｇｅ Ｓ，Ｍａｔｓｕｂａｒａｋ，Ｙ￣ｈｉｄａ Ｍ，ｅｌ ａ１．Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｖｅｒｂ— 成的双链ＲＮＡ所产生的效应存在着显著差异，外显 ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ。ｃ—ｅｒｂＢ一２ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７ ａｎｄ ｉｔｓ ｌｉａｒ ｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｉｎ— 子序列的双链ＲＮＡ能产生特异和高效的基因抑制 ａｇａｓｔｒｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９８６，６：９５５． ［４］Ｌｅｍｏｉｎｎｅ ＮＲ，Ｓｙａｄｄｏｎ Ｓ，Ｄｉｃｋｓｏｎ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ １￣ｔｎ８． 作用，而只针对内含子序列的双链ＲＮＡ则不能产生 ｍｅｌｎｂｒａｌ＇ｌ（２ｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃ—ｅｒｂＢ一２ ｐｒｏｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅｓａｔ 这种作用。②高效性。ＲＮＡ干涉抑制基因表达具 ｃａｎｃｅｒ［ｊ３．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９０，２：３３２． 有很高的效率，对目的基因表达的抑制程度可以达 ［５］Ｇｉｌｍｏｕｒ ＬＭ，Ｍａｅｌｅｏｄ ＫＧ，ｌｃＣａｉｇＡ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｒｂＢ４／ＨＥＲ－４ 到缺失突变体表型的程度；而且数量相对很少的双 ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃ．ｎｃｅｒ［Ｊ］．ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００１，６１ 链ＲＮＡ分子（数量远少于内源ｍＲＮＡ的数量）就能 （５）：２１６９． ［６］Ｓｉｍｐｓｏｎ ＢＪ，Ｐｈｉｌｌｐｓ ＨＡ，Ｌｅｓｓｅｌｌｓ ＡＭ，ｅｔ ａ１．Ｃ－ｅｒｂＢ ｇｒｏｗｔｈ—ｆａｃｔｏｒ－ｒｅｃｅｐ— 完全抑制相应基因的表达，这表明ＲＮＡ干涉效应中 ｔｏｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｔｕｍｕｒｓ［Ｊ］．１ｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１９９５，６４（３）：２０２． 存在信号分子的扩增机制。③传染性。双链ＲＮＡ ［７］Ｗｏｎｄ ＹＦ，Ｃｈｅｕｎｇ ＴＨ，Ｌａｉｎ ＳＫ，ｅｌ ａ１．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｃｅ ｏｆ 分子能够通过细胞膜、细胞间隙和细胞屏障而被转 ＨＥＲ－２／ｎｅｕ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．［Ｊ］．Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｂｓ— 运。ＲＮＡ干涉现象广泛存在于真核生物中，一方面 ｔｉｅ Ｉｎｖｅｓｔ，１９９５，４ｏ（３）：２０９． 具有抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、防止自私基因 （收稿日期：２００７—１０—１８）
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