(完整)细菌革兰氏染色作业指导书

修订号：0 革兰氏染色

一、 目的

更好的观察细菌形态，并可按染色反应加以分类鉴别.

二、 原理

1、 化学学说:碘液在菌体内与结晶紫结合后又和菌体内的核糖核酸镁盐-蛋白质

复合物结合，此结合物不易被95%乙醇脱掉，呈革兰氏染色阳性。因革兰氏阴性菌缺乏核糖核酸镁盐，故对碘与结晶紫结合物摄取少，且不牢固，易被乙醇脱色，而呈革兰氏染色阴性。

2、 等电点学说:革兰氏阳性菌的等电点在PH2-3，比阴性菌（PH4—5）更低。加

之碘为弱氧化剂，可降低革兰氏阳性菌的等电点，使两类菌的等电点差异扩大.因此，阳性菌和碱性染料的结合力比阴性菌更强。

3、 渗透性学说:阳性菌含粘肽多、糖多,酒精使其脱水而致细胞壁间隙缩小,通透

性降低，在菌体内保留了染料—碘复合物，故呈紫色。阴性菌胞壁含粘肽少，通透性不受影响，菌体内染料—碘复合物较易透出，失去紫色,被复染成为红色。

三、 标本

痰涂片、分泌物涂片、细菌涂片等。

四、 染液

第一液：结晶紫乙醇饱和液(2g结晶紫溶于95％乙醇20ml内）+10g/l草酸铵

水溶液80ml混匀。

第二液:碘1g，碘化钾2g,加少许蒸馏水，充分振摇，溶解后加蒸馏水至300ml。 第三液：95％乙醇或乙醇、丙酮(7：3）混合液。

第四液：稀释碳酸复红或沙黄溶液（2。5％沙黄乙醇液10ml加蒸馏水90ml

混匀)（碱性复红8g溶于95%酒精100ml中制成饱和液,取10ml加入5％碳酸水溶液90ml混匀)用时用蒸馏水稀释10倍即可。

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五、 质量控制措施

每周做一次革兰氏阴、阳性质控菌株染色对照（金葡菌、大肠杆菌）.

六、 操作步骤

1、 已固定的细菌(或其它）涂片,滴加第一液染1分钟水洗。 2、 冲去残水滴加第二液，媒染1分钟，水洗。

3、 去残水,用95％酒精脱色，至无明显紫色液渗出为止，水洗。 4、 用第四液复染10-30秒钟，水洗，干后镜检。 七、 结果可报区间

革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

八、 实验室解释

1、 染色关键在于涂片和脱色，故涂片要厚薄适宜。脱色时若涂片上有水分，则

脱色力强，易形成假阴性。

2、 涂片干燥宜自然干燥,固定时通过火焰三次即可，不宜过分，以免造成菌体变

性而影响染色效果。

3、 染色反应受菌龄影响，故所染色的细菌培养不超过24—48h。 九、 安全防护措施

操作中，穿好工作衣，戴防护口罩、手套，必要时戴眼罩，严格按操作规程,结束后，用0.2％消毒灵擦拭实验台、显微镜手柄、载物台等，然后用0.2%消毒灵泡手，实验室用紫外线消毒30分钟。

十、 标本处理

已检验过的标本作高压灭菌后由专门人员统一处理. 十一、参考文献

诊断细菌学,李仲兴等主编，第一版，香港：黄河文化出版社

标题：细菌培养技术 文件编号：SMXGKYY —SOP-001 生效日期:2015年04月01日 编制人: 批准人（签字)： 版本号：A 修订号：0 发布日期：2015年04月01日 发布部门：质量管理小组 审核人： 细菌培养技术

目的：无菌操作接种、培养是细菌学实验室中最基本、最重要的操作技术,它是鉴

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定细菌的首要前提。

器材：酒精灯、95％酒精、接种环(针)、培养皿（瓶）、烛缸、火柴等。

一、 无菌操作技术的基本要求

1、 临床细菌检验的所有操作，均必须在无菌条件下进行，即在酒精灯火焰附近

或在超净工作台内进行。

2、 由临床标本或培养物中取材作检查时，必须使用接种环（针），使用前后均需

火焰灭菌。

3、 从培养瓶或试管培养物中取标本时，在打开瓶口、试管口或关闭前，均要在

火焰上通过1—2次，瓶塞或试管塞用无名指及小指夹住，操作完毕后塞回。

4、 不慎打破培养物瓶（管）时，应报告负责人后，用0.2％消毒灵处理污染的

台面或至少覆盖30分钟.打破的器皿集于容器内高压灭菌，台面及地面再进一步消毒清洗.

5、 工作完毕后，实验台用0.2％消毒灵擦拭,双手用0。2％消毒灵浸泡,再用肥

皂和清水刷洗干净。。

二、 接种方法

（一） 平板接种法:平板划线接种是细菌分离培养的常用技术，主要使标本或培

养物中的混合细菌能在培养基表面分散生长形成单个菌落。

1、 曲线划线分离法：接种环菌灭后挑取标本或菌液少许呈45度角，在平板

1/5处轻轻涂布，然后左右来回以曲线形成划线接种，倒置37℃温箱内培养24h后观察结果.

2、 分区划线分离法：接种环于平板内分划五区，每划完一个区域烧灼环一次

后倒置35—37℃培养.

（二） 穿刺接种法:多用于保存菌种观察动力及做厌氧培养,亦可用于观察细菌

对糖类的分解反应,培养基为半固体。 方法：1、左手持细菌培养物.

2、右手持接种针酒精灯上烧灼，冷却后挑取细菌.

3、左手持半固定培养基,右手小指夹住棉塞并取下，管口火焰灭菌，

将接种针插入培养基中央,穿刺近底部1/3处，再沿原穿刺线抽出在斜面上做连续曲线接种。

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4、试管口在火焰上充分灭菌，塞棉塞,灭菌接种针。

6、接种后的半固体培养基，置试管架上，35—37℃孵育箱培养

三、 培养方法

（一） 一般培养法（又称需氧培养法)：将已接种好的平板、斜面和液体培养基

等，置35—37℃孵育箱中18—24h，难以生长者培养2—7天甚至半个月。

（二） 二氧化碳培养法:将某些细菌如脑膜炎球菌，嗜血杆菌等置于CO2环境中进

行培养。

我室采用烛缸法：将已接种过的平板,置于有盖的干燥玻璃缸中，缸盖及缸口涂凡士林，放入已点燃的蜡烛,用盖密闭,蜡烛数分钟后自行熄灭,此时缸内均含5—10％CO2。最后将缸移入35℃孵育箱中培养。

（三） 厌氧培养法

四、参考文献

诊断细菌学，李仲兴等主编，第一版,香港：黄河文化出版社，1992

标题：临床细菌学室内质量控制 文件编号：SMXGKYY -SOP-001 生效日期：2015年04月01日 编制人： 批准人（签字)： 版本号：A 修订号：0 发布日期：2015年04月01日 发布部门:质量管理小组 审核人： 临床细菌学室内质量控制

目的：细菌室内质控是细菌检验工作的核心，是做好室间质评的基础和前提，做好此项工作,才能在室间质评中取得好成绩，也就能更好地为患者的诊疗服务. 一、细菌检验人员及其培养教育：须在实践中继续学习，不断提高理论水平和技术

操作能力，编写操作手册。 二、仪器设备的功能监测

（一） 灭菌器械的效果监测:高压灭菌器每月一次,我室采用嗜热脂肪芽胞杆菌

监测。

（二） 恒温孵育箱、水浴箱及冰箱，每天记录其温度,开始工作及工作结束时均

应记录，并绘制温度控制图,孵育箱温度应为35℃±1℃，水浴箱37℃±0。

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5,冰箱冷藏为4℃±2℃，冷冻为-20℃±5℃

三、培养基的质量控制

（一） 制备培养基的记录：包括收到日期，制备时培养基名称、配方、日期，制

作者签名。成品培养基记录购入日期及使用日期，并按条件贮存，用已知阳性或阴性菌株进行检测。

（二） 培养基的外观检查:对制备或购入成品培养基，要观察其颜色和透明度。

发现异常要停止使用。

（三） 培养基的性能监测：对于分离、选择、鉴别培养基,要对其用参考菌株进

行监测，性能符合标准方可使用。

四、 试剂、染色液及抗血清的质量控制

试剂、染液，配制后注明名称，配制日期及配制者，用已知阳性和阴性参考菌株进行监测,合格后方能应用。

（一） 根据试剂和染色液本身稳定性和使用频度定期检查核对：较稳定如靛基质

每周检测，H2O2每天用时均应检测,氧化酶纸片应避光低温保存，各种生物制品应置4℃冰箱保存等。

（二） 抗血清的质量控制：应记录收到日期，观察其外观是否符合标准,使用时

前先用已知阴、阳性菌株检查是否合格，期间每三个月用标准菌株检测一次其敏感性及特异性,有效期内使用,置4℃冰箱保存。

五、 处理临床标本的质量控制 （一） 标本采集和运送 1、

标本采集

（1） 时间:早期、急性期、症状典型时或用药前。 （2） 方法：据不同的菌种而不同。

（3） 技术：除痰、粪、肛拭子、咽拭子等,均应无菌操作并盛于无菌容器内。 （4） 量：不得过少，要具代表性。

（5） 防护：注意安全，防污染，传播和自身感染。 2、

标本运送：最好床边接种，须运送时,视标本情况和培养目的作保温、

冷藏、厌氧运送或将标本种入培养基内送检。

（二） 直接涂片:除血标本外,几乎所有临床细菌标本均应做直接涂片.

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（三） 分离培养和鉴定

1、 分离培养:据标本性质，临床诊断，直接涂片染色镜检结果，选择适当

培养和培养方法.

2、 鉴定：按科、属、种顺序进行。

六、 质控用标本菌株

（一） 具备条件：形态染色反应，生理生化及血清学特性典型而稳定。 （二） 来源：质控中心或研究所均可提供。

（三） 保存:冷冻干燥法、超冰冻保存法、培养基保存法.

七、抗生素敏感试验的质量控制

细菌对抗生素的敏感试验,对临床医师选择适当的抗生素治疗感染性疾病十分重要,也是合理，安全用素的前提，故须做好抗生素敏感试验的质量控制，多采用纸片扩散法和稀释法进行。

质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希氏菌ATCC25922、绿脓杆菌

ATCC27853,用来测定方法的准确性。

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