动物细胞工程制药技术

动物细胞工程制药技术 摘要

生物制药产业以基因工程、抗体工程、细胞工程为主要代表。文章主要讲述动物细胞工程技术。动物细胞工程制药是动物细胞工程技术在制药行业方面的应用。当前动物细胞工程所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞器特别是细胞核移植技术、染色体改造技术、转基因动植物技术和细胞大量培养技术等方面。

关键词：动物细胞工程制药细胞融合细胞大规模培养核移植 1、动物细胞工程制药技术 1、1.细胞融合

细胞融合指在诱导剂或促融剂作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互接触，进而发融合并形成杂种细胞的现象。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一，不仅在农业、工业的应用领域不断扩大，而且在医药领域也取得了开创性的研究成果，如单克隆抗体、疫苗等生物制品的生产。在动物体细胞融合技术的基础上 Kohler G和 Milstein C将能产生特异性抗体的原代 B 淋巴细胞与肿瘤细胞进行融合，创立了单克隆抗体制备的方法。国内外已培育出了许多具有很高实用价值的杂交瘤细胞株系，它们能分泌用于疾病诊断和治疗的单克隆抗体，如甲肝病毒、抗人 I g M 、抗人肝癌和肺癌、抗M-CSFR（Macrophage Colony-Stimulat-ing Factor Receptor，巨噬细胞集落刺激因子受体）胞外区的单克隆抗体等。目前单克隆抗体技术已趋成熟，许多产品已经进入产业化的生产阶段。

此外利用细胞融合技术可以生产各种免疫疫苗，肿瘤细胞 / 树突状细胞融合疫苗是近年来国内外恶性肿瘤免疫治疗研究的热点, 在各种动物模型及病人身上观察到肿瘤的消退。Avigan 等将乳腺癌或肾癌病人的自体癌细胞与树突状细胞在含有人粒 - 巨噬细胞集落刺激因子、白介素 - 4 的自体血清中培养，加入聚乙二醇使两种细胞产生融合, 融合细胞疫苗能使肿瘤消退，显示其在肿瘤治疗方面具有良好的应用前

景。

1、2.转基因动物

利用转基因动物乳腺反应器生产药用或食品蛋白是生物制药领域近年来研究的热点之一。因为乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响到转基因动物本身的生理反应，从转基因动物的乳汁中获取的目的基因产物，不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白经过了充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，因此又被称为动物乳腺生物反应器，所以用乳腺表达人类所需蛋白基因的羊、牛等产量高的动物就相当于一座药物工厂。20 世纪 80 年代中期，英国科学家克拉克首先在鼠的乳腺组织高效表达了人抗胰蛋白酶因子基因，开创了研制动物乳房生物反应器的先河。

据美国遗传学会预测，到2010年，所有基因工程药物中利用动物乳房生物反应器生产的份额将高达95％。国外现已有数十家以动物乳腺反应器为核心技术的公司，可生产α 1 －抗胰蛋白酶、人红细胞生成素、乳铁蛋白、人血清白

蛋白、人血红蛋白及人凝血因子

Ⅸ、Ⅷ和抗凝血酶Ⅲ、血纤维蛋白原、t P A 等十余种稀有药品，但只有为数极少的几种药用蛋白上市。2006 年 6 月，由美国 Genzyme 转基因公司研制成功的世界上第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物棗重组人抗凝血酶Ⅲ（商品名：ATryn 牋）已经获准上市。

我国自 1998 年在国家“863 ”计划中将“转基因动物乳腺生物反应器”作为重大研究项目以来，也取得了一些较好的成绩。1996 年研制成功的能在乳腺中表达人凝血因子、EPO 的转基因羊；1 998 年曾溢滔等获得了能表达人血清白蛋白的转基因奶牛; 2 0 0 0 年中国农业大学与北京兴绿原生物技术中心合作，成功获得了我国首例转有人 a l 一抗胰蛋白酶基因的转基因羊1131；2005 年中国农业大学和北京济普霖生物技术有限公司联合研制的人乳铁蛋白和人乳清白蛋白转基因奶牛均获得高效表达，含量分别达到 3.4 克 / 升和 1.5 克 / 升，标志了我国首次获得可商业化生产的动物乳腺生物反应器重组人类蛋白。

目前科学家们正在加紧开展重组蛋白纯化、临床前试验和临床试验等研究，力争早日实现我国动物乳腺生物反应器制药技术产业化。

1、3.细胞核移植技术

细胞核移植技术，是指将一个动物细胞的细胞核移植至去核的卵母细胞中，产生与供细胞核动物的遗传成份一样的动物的技术。科学家们已经先后在绵羊、小鼠、牛、猪、山羊等动物上获得胚胎细胞核移植后代，目前，体细胞克隆也在牛、山羊、小鼠等物种上均获得了成功。若将转基因与细胞核移植技术获得的克隆动物工厂相结合，在生物制药方面具有巨大的潜在应用价值。1998 年，Rohl 等用非静息期胎儿或纤维细胞成功克隆出 3只健康、同类的携带外源标记基因的转基因克隆。Schnieke 等用此法成功克隆出 3 只携带有人凝血因子Ｉ X 基因转染绵羊早期胎儿成纤维细胞，以该细胞系为供体移植到去核卵母细胞中，经过电和化学刺激后，将卵母细胞植入假孕母绵羊体内发育，获得这 3 只绵羊，这 3 只绵羊能高水平地表达人凝血因子Ｉ X （125 μ g/ml ）。Cibelli等同样也获得3头转基因牛。这些研究展示了转基因克隆动物技术的可能性，为细胞工程制药带来了光明前景。

1、4.动物细胞大规模培养

动物细胞的大规模高效培养技术是生物制药的关键技术，通过动物细胞培养生产生物产品已成为全球生物工业的主要支柱。目前动物细胞培养生产较多的生物制剂是蛋白和抗体，通常采用中国仓鼠的卵巢细胞，事先将能产生某种蛋白质

药品的基因片段与仓鼠卵巢细胞的 D N A 融合．再在培养液中大量培养它们、最后得到所需药品。与微生物发酵法比，虽然产量相对较低。但设备费用节省得多，如属于小品种、小产品类生物工程产品，可采用此法。

目前用于动物细胞体外培养的生物反应器有机械搅拌式、气升式、中空纤维式、回转生物反应器等。国外占主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养，为提高细胞的产率，可采用流加或灌注培养及微载体培养等相关技术。美国Genentech 公司使用 CHO 细胞以 12,000L 搅拌式生物反应器培养槽生产 t - P A 重组蛋白以及治疗癌症的生物药物。

美国 G i b c o 公司建立的流加悬浮培养 rCHO 表达 r β Gal 系统，采用化学修饰的无蛋白 C H O 细胞培养基并增加 T C A 循环，生物反应器中活细胞密度最高可达 107cell/ml。国内第四军医大学采用5L CelliGen 反应器连续灌注培养杂交瘤细胞，培养第 9 天细胞密度达到8 × 106cells/ml 以上[17]。目前国内未见有万升级的生物反应器用于生产的报道，同时我国有关商品化大规模动物细胞反应器产品还处于空白，有待于进一步改进现有生物反应器设计或设计新型的生物反应器。

2、制造实例

如今，利用动物细胞生产的生物制品已日益增多。美国自1996年以来批准的33个产品中有25个是用动物细胞生产的。下面就几个在动物细胞工程制药的发展史上具有重要意义的产品进行介绍。

2、1 类淋巴细胞干扰素

类淋巴细胞干扰素是由一株从Burkitt淋巴瘤的患者获取Namalva细胞生产的干扰素，它含80%左右的IFN-α，20%左右的IFN-β。该干扰素首先由英国的Wellcome公司的Fante和Finter等开发成功，并扩大至8000L罐生产。该产品1986年先在英国获准进入市场，商品名为“Wellferon”。1999年Wellferon获美国FDA批准进入美国。该干扰素获准生产在动物细胞发展技术史上是一个很重要的里程碑，因为这是第一个获准用肿瘤细胞系生产的人用药品。

类淋巴细胞干扰素的生产工艺大致如下：先将细胞逐级放大直至4000L或8000L罐，培养基用RPMI1640培养基，加10%小牛血清。培养方式主要是搅拌式批次培养，当细胞密度达1×106/ml时，加入2nmol/L丁酸钠起动48h，接着用仙台病毒（50HAU/ml）诱生，18h后冷却至5～10 ℃，收集培养液，连续离心分离细胞，对上清液进行分离纯化。

类淋巴细胞干扰素已被广泛应用于临床治疗多种病毒性疾病，如乙型肝炎、丙型肝炎，以及多种肿瘤病的治疗，如毛细血管白血病、Kaposi肉瘤等。

2、2 组织型纤溶酶原激活剂

据不完全统计，各种血栓病已成为许多国家人口死亡和致残的第一位原因。我国患各种血栓病的患者估计在1300万以上。对于血栓病的治疗方法多种多样，但目前主要的疗法仍是溶血栓法。组织型纤溶酶原激活剂做为第二代特异性的溶栓药于1987年被FDA批准上市。它是由美国Genetich公司用CHO细胞表达的，也是第一个用动物细胞大规模培养生产的基因工程产品。

2、3 尿激酶原

作为第二代的又一个特异性的溶栓药，单链尿型纤溶酶原激活剂—尿激酶原目前在许多国家进行临床Ⅲ期试验，估计不久即可上市。在国内，南京大学是用大肠杆菌表达的，而军事科学院生物工程研究所则是用CHO细胞表达的，目前正和天津天士力公司一起进行试验。

尿激酶原是一种碱性蛋白，具有特异的溶血栓作用，具有很好的发展前景。

2、4 促红细胞生成素

促红细胞生成素，又称血细胞生成素、红细胞刺激因子，是一种酸性糖蛋白，是第一个被发现并批准应用于临床的造血生长因子，也是迄今为止产值最高的基因工程产品。它主要用于多种贫血，包括慢性肾衰性贫血、恶性肿瘤放疗和化疗引起的贫血等。

由于该药的用量很小，因此有的单位仍采用传统的转瓶生产工艺。也有单位为了达到高产目的，采用了固定化灌流培养的生产工艺。

2、5 凝血因子Ⅷ

由先天性缺乏凝血因子Ⅷ而引起的出血称为甲型血友病，早期治疗采用输入全血或血浆，但由于血浆内凝血因子Ⅷ的浓度很低，因此效果不理想。20世纪80年代以后，采用单克隆抗体亲和层析，使产品的纯度进一步提高。尤其是由于研究成功了一系列血浆的病毒灭菌法后，使由血浆制备的“极纯”产品，如Monoclate等一直沿用至今。

2、6 乙型肝炎疫苗

乙型肝炎是由乙肝病毒引起的，约占所有病毒性肝炎的40%，它可以急性发病也可以形成慢性肝炎，并进而引发肝硬化、肝癌，而其中很大的一部分人是健康的病毒携带者，不出现症状，但表面抗原阳

性，常常是重要的传染源。在我国，

这样的慢性病毒携带者约有一亿人，是对公共卫生的一个重要威胁。

至今已被批准的乙肝工程疫苗有两种宿主细胞的，一种是酵母表达的，另一种是CHO细胞表达的。我国病毒研究所的任贵方等在1987年就研究成功了用CHO 细胞表达的疫苗。他们用的是NBS公司生产的微载体篮式生物反应器连续灌注培养CHO细胞，然后以14000r/min连续离心去除细胞残骸提取上清，再经Butyl S Sepharose Fast Flow 疏水柱层析—Sephadex G 25脱盐—DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析—Sepharose 4 Fast Flow 凝胶过滤，即可得纯品。

结论

文章主要讲述了细胞融合、转基因动物、细胞核移植技术、动物细胞大规模培养等动物细胞工程制药技术，又介绍了几个细胞工程制药的实例。我国动物细胞工程制药目前仍处于起步阶段，与欧美国家相比还有很大差距，虽然目前可生产多种有重要价值的蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等，但大部分还处于实验和临床阶段。作为现代生物技术之一的细胞工程技术在近半个世纪来突飞猛进,并已在医药领域取得了许多具有开创性的研究成果,如通过细胞融合技术形成的杂交瘤细胞生产的单克隆抗体已广泛用于临床治疗, 并显示出独特的疗效, 获得了很好的社会和经济效益。随着细胞工程技术研究的不断深入,它的前景及其产生的影响将会日益地显示出来。

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