壳聚糖的提取及其脱乙酰化研究

鲁东大学学报（自然科学版）　Ｉｍｄｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｊｏｕｒｎａｌ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｉｔｏｎ）　２００６，２２（３）：２Ｏ８—２１Ｏ　壳聚糖的提取及其脱乙酰化研究　薛志欣　，杨桂朋　，马晓梅　，张希琴　（１．青岛大学化学化工与环境学院，山东青岛２６６０７１；２．中国海洋大学海洋化学理论与工程技术实验室，山东青岛２６６００３）　摘要：从对虾壳中提取甲壳素，并探讨其脱乙酰化过程中碱处理方式及温度对脱乙酰度和分子量的影响．结果　表明：加入乙醇、升高温度能够提高甲壳素的脱乙酰度；乙醇存在下的脱乙酰反应是一级反应；采用问歇碱处　理的方式能够在提高脱乙酰度的同时，保持较高的分子量．　关键词：甲壳素；壳聚糖；脱乙酰；碱处理　中图分类号：Ｑ６３６．１　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７３．８ｏ２Ｏ（２０ｏ６）ｏ３．０２０８．０３　甲壳素是一种天然氨基多糖，学名为（１，４）．　２．乙酰基．２．脱氧．　Ｄ．葡聚糖，是Ｎ．乙酰基．Ｄ．葡　１材料和方法　胺糖通过　．（１，４）苷键联结的直链状多糖ｎ］．甲壳　素是许多甲壳类动物（如虾、蟹）及昆虫等外壳的　重要组成成分，同时也存在于菌类、藻类的细胞壁　中　ｊ（　，还可来源于有机酸类、抗生素与酶的酿　造副产物．甲壳素是一种十分丰富的天然资源，在　自然界中的蕴藏量仅次于纤维素，是世界上储量　最多的动物性多糖．甲壳素不溶于水和酸性介质．　壳聚糖是甲壳素脱乙酰化后的产物，其溶解性能　较甲壳素有较大提高，可溶于酸性介质中．由于甲　壳素是天然高分子化合物，具有许多优良的特　性Ｌ３，引，所以，自１９７７年在美国波士顿召开了第一　次有关甲壳素壳聚糖的国际会议后，甲壳素的开　发应用得到较大的发展，在食品、化妆品、废水处　理、重金属回收、生物、医药、照相、纺织、印染、造　１．２实验方法　１．１仪器与材料　主要仪器有ｕＶ．７５７ＣＲＴ紫外可见分光光度　计，Ａｃｃｕｌａｂ电子天平（ＡＬＣ．２１０．２），１０１．１型电热　鼓风干燥箱，电热恒温水箱，予华循环水式真空　泵，乌氏粘度计，碱式滴定管．　材料为食用后废弃的对虾外壳，商品壳聚糖　（脱乙酰度为９０％）由青岛海汇生物股份有限公　司提供，其他试剂均为国产分析纯．　１）壳聚糖的制备　Ｊ　将虾壳去腿去杂质后，　流水冲洗，洗净残余的虾肉，于６０℃烘箱中烘干，　用研钵磨碎．称取１０　ｇ虾壳３份，于１００　ｍＬ　５％　ＨＣ１中浸泡４ｈ至元气泡冒出，再补加５０　ｍＬ　５％　ＨＣ１，浸泡２ｈ，除去虾壳中的钙质和无机盐，抽滤，　用去离子水洗至中性，加１００　ＨｌＬ　１０％ＮａＯＨ于　５０￣Ｃ水浴中加热２ｈ，除去蛋白，过滤，用去离子水　洗至中性，然后用０．１％ＨＣ１浸泡０．５　ｈ，再加有效　纸等领域中均有广泛应用．对虾是生长在渤海、黄　海水域的一种常见海产品，其外壳含有丰富的甲　壳素．据不完全统计，仅青岛地区每年食用对虾遗　弃的虾壳达上千吨，这些遗弃的虾壳如能得到妥　善利用，既可变废为宝，又能减少环境污染．本文　以青岛海域产对虾壳为原料，通过脱盐、脱蛋白、　脱乙酰化处理得到了质量较高的壳聚糖，并对甲　壳素脱乙酰的碱处理过程进行了详细研究，可望　为对虾壳废弃物的综合利用提供实验依据．　氯为０．５％（摩尔分数）的ＮａＣＩＯ溶液１００　ｍＬ，在　８０℃水浴中反应４　ｈ，水洗至中性，抽滤，烘干后得　白色粉末状甲壳素分别为２．０８，２．００，２．１２　ｇ，平均　产率为２０．６％．用碱液水解即得壳聚糖．　收稿日期：２ＯＯ６．０６．２５　基金项目：山东省“泰山学者”建设工程专项经费资助课题　作者简介：薛志欣（１９７３一），女，讲师，中国海洋大学在职博士，研究方向为海洋天然产物，鲁东大学化学与材料科学学院１９９２级校　友，（Ｅ—ｍａｉｌ）：ｘｕｅｚｈｉｘｉｎ９２＠ｙａｈｏｏ．ｔｏｍ．ｃｎ．　维普资讯 http://www.cqvip.com

第３期　薛志欣，等：壳聚糖的提取及其脱乙酰化研究　２０９　２）壳聚糖的理化性质表征　脱乙酰度的测　定以甲基橙作为指示剂，采用酸碱滴定法［　］（Ｐ２５　；　分子量的测定Ｌ６ｊ用０．１　ｍｏｌ／Ｌ　ＨＡｃ＋０．２　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１溶液为溶剂，采用逐步稀释法，用乌氏粘度　计测定不同浓度下壳聚糖的粘度，得到其特性粘　度［叩］．按公式［叩］＝ＫＭｖ　计算样品的粘均分子　量（　），其中Ｋ＝１．８１，口＝０．９３．将壳聚糖溶解　在２％ＨＡｃ中制成０．１％的溶液，于２ｏ０—８００　ｎｍ　下测其紫外光谱．将甲壳素、壳聚糖与ＫＢｒ压片，　于８００—１ｏ００　ｃｍＩ１下测其红外光谱．　２结果与讨论　２．１壳聚糖的制备　壳聚糖生产的关键是脱盐、脱蛋白和脱乙酰　三步．在虾壳中，不溶性盐的主要成分是碳酸钙，　加入盐酸后，会有二氧化碳气体放出，当气泡消失　后，表明虾壳中碳酸钙的含量已很低，继续浸泡　２ｈ，可以认为脱盐完全．向脱盐后的虾壳中加入　１０％的ＮａＯＨ溶液，可使虾壳中的蛋白溶于碱液，　从而将蛋白去掉．而加入ＮａＣＩＯ的主要目的是分　解色素——虾红素．壳聚糖醋酸溶液在紫外可见　光区没有吸收峰，表明蛋白和色素去除比较完全．　２．２　甲壳素的脱乙酰化反应　甲壳素经浓碱液处理，分子中的乙酰基部分　逐渐水解脱除．该反应是碱催化反应，反应式为　ＣＨ，０Ｈ　ＣＨ，ＯＨ　０＋　＿Ｊ门　当分子中有半数乙酰基脱除，成为半制成甲壳素，　这种半制成甲壳素在酸液中只能溶胀不能溶解　（也有报道说这种半制成甲壳素可以在水中溶　解Ｌ７　Ｊ），当分子中剩余的乙酰基继续脱除，就能在　酸液中溶解，成为壳聚糖．　般来说，壳聚糖的脱乙酰度随反应的时间、　温度和碱液浓度的增大而提高，但文［８］的研究表　明，当氢氧化钠的浓度小于３０％时，即使提高反　应的温度及时间，脱乙酰度也不会大于５０％．笔　者以脱乙酰度（ＤＤ）为６５％的壳聚糖为原料，在反　应介质中加入无水乙醇，提高反应介质的碱性．结　果表明，当采用２５％的ＮａＯＨ水溶液在８０℃下脱　乙酰反应１ｈ，产物的ＤＤ为６７．９８％；如果采用　２５％ＮａＯＨ水乙醇液（Ｈ２０：Ｃ２Ｈ５ＯＨ＝１：１，ｖ／ｖ），同　样条件下脱乙酰基，产物的ＤＤ为７９．２５％．这表　明加入乙醇确可以提高产物的脱乙酸度．　为验证反应时间与温度对乙醇存在下甲壳素　脱乙酰反应的影响，我们做了如下实验：将１ｇ壳　聚糖（ＤＤ＝６５％）分散于２０　ｍＬ　３０％的ＮａＯＨ醇水　溶液（Ｈ２０：Ｃ２Ｈ５ＯＨ＝１：１，ｖ／ｖ）中，分别于４０％，　５０％，６ｏｃｃ下恒温反应１，２，３　ｈ，其ＤＤ值见表１　表１　乙醇存在下反应时间与温度对ＤＤ的影响　以４０℃，５０￣Ｃ，６０￣Ｃ下产物的［一Ｉｎ（１一ＤＤ）］　分别对反应时间（ｔ）作图，得到斜率为０．９９８６，　０．９９９０，１．ｏ０００的三条直线（图１），说明乙醇存在　下的脱乙酰反应为一级反应［　．　０　０　＝　图１脱乙酰度与时间、温度的关系　文［１０，１１］等在实验中发现，无论增大ＮａＯＨ　溶液的浓度、提高反应温度，还是延长反应时间，　都不能得到高脱乙酰度（ＤＤ＞９０％）的壳聚糖，相　反，在这个过程中，又引起了分子量的急剧下降．　本实验中采用了间歇碱处理Ｌ８　Ｊ的方式，使处理过　的壳聚糖既得到了高的脱乙酰度，同时分子量的　变化又不大（表２）．　表２不同处理方式对ＤＤ，肘ｖ的影响　说明：反应条件为５０％ＮａＯＨ，ｌ１０％；ａ间歇碱处理：碱性溶　液中加热ｌｈ，水洗至中性，再在碱性溶液中加热处理ｌｈ，水洗，如　此反复进行；原料壳聚糖的　ｖ＝４．６６×ｌ　０５，ＤＤ：６５％　２．３　甲壳素与壳聚糖的红外光谱　图２是甲壳素与壳聚糖的红外光谱．壳聚糖　维普资讯 http://www.cqvip.com

２１Ｏ　鲁东大学学报（自然科学版）　第２２卷　和甲壳素的红外光谱差异主要表现在酰胺谱带、　氨基谱带等．甲壳素的酰胺谱带是ｌ　６６０　ｃｍ～，　参考文献：　Ｄｗｅｈｚ　Ｎ　Ｅ．Ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｃｈｉｉｔｎ【Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ，１９６０，４４：４１６—４５３．　图中Ａ，Ｂ都有此吸收峰，只是壳聚糖的吸收峰　低，说明经过脱乙酰化反应，壳聚糖分子中仅存少　量乙酰基．一ＮＨ２的吸收出现在ｌ　５９６　ｃｍ－１处．　蒋挺大．甲壳素［Ｍ］．北京：化学工业出版社，２００３：　４—６：２５９—２６３．　Ｇｅｎｔａ　Ｉ，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ　Ｍ，Ａｓｔｉ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｇｌｕ—　ｔａｒｌｄｅｈｙｄｅ　ｏｎ　ｄｒｕｇ　ｒａｅｌｅａｓｅ　ａｎｄ　ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　３　４００　ｃｍ－１左右的宽峰是（）＿一Ｈ的伸缩振动吸　收峰与Ｎ—Ｈ的伸缩振动吸收峰重叠而成的多　重吸收峰，也就是对照糖残基上的羟基和氨基（或　ｏｆ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ［Ｊ　ｊ．Ｃａｂｏｎｈｙｄｒａｔｅ　Ｐｏｌｙｍｅｍ，　１９９８，３６：８１—８８．　乙酰氨基）．这个宽峰说明这些羟基和氨基间存在　着较强的分子内和分子间氢键．２９３４－－２８８２　ｃｍ　处的吸收峰分别是糖残基上的甲基或亚甲基的　ｃ—Ｈ伸缩吸收峰，此外，在甲壳素样品中还存在　３　１０８　ｃｍ－１的吸收峰，其归属目前尚未定论．　Ｂｅｎｅｓｃｈ　Ｊ，Ｔｅｎｇｖａｌｌ　Ｐ．Ｂｌｏｏｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｏｎｔｏ　ｃｈｉ—　ｔｏｓａｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉｌａｓ，２００２，２３：２５６１－２５６８．　范国枝，韦一良．红螫螫虾壳制备壳聚糖的研究　［Ｊ］．精细化工中间体，２００４，３４（２）：４７—４８．　Ｒｏｂｅｒｔｓ　Ｇ　Ａ　Ｆ，Ｄｏｎｓｚｙ　Ｊ　Ｇ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ￣ｉｓｃｏ—　ｍｅｔｒｉｃ　ｃｏｎｓｔａｎｔｓ　ｏｆ　ｃｈｉｔｏｓａｎ【Ｊ　Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｊ¨　纠　引　　］　］　］　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｓ，１９８２，４：３７４—３７７．　１¨　　＿　１　Ｊ　］　］　］　…　Ｓａｎｎａｎ　Ｔ，Ｋｕｒｉｔａ　Ｋ，１ｗａｋｕｒａ　Ｙ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｓｏｌｕｂｌｉｌｉｔｙ［Ｊ］．Ｍａｋｒｏｍｏ　Ｃｈｅｍ，１９７６，１７７：３５８９．　沈建，何春桃，陈兴凡，等．不同反应条件对壳聚糖　性能的影响［Ｊ］．天然产物研究与开发２００５，１７　（Ｂ（）６）：３５—３８．　傅献彩，陈瑞华．物理化学（下）［Ｍ］．北京：高等教　图２　甲壳素（Ａ）、壳聚糖（Ｂ）的红外光谱图　育出版社，１９８０：３９５—３９７．　Ｍｉｍａ　Ｓ，Ｍｉｙａ　Ｍ，１ｗａｍｏｔｏ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｈｉｇｈｌｙ　ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｅｄ　由上述实验可知，对虾壳中含有丰富的甲壳　素，由对虾壳提取甲壳素产率可达２０％以上；在　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ａｎｄ　ｉｓｔ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ａｐｐｌ　Ｐｏｌｙｍ　Ｓｃｉ，１９８３，　２８：１９０９．　碱液中加入乙醇可以提高对虾甲壳素的脱乙酰　度，实验表明乙醇存在下的脱乙酰反应为一级反　张一峰，张富尧，陈剑峰，等．高脱乙酰度壳聚糖的　制备及结构与性能［Ｊ］．浙江化工，１９９２，２３（２）：２ｏ＿＿　２３．　应；间歇碱处理可以得到脱乙酰度较高的壳聚糖，　而分子量改变并不大．　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｔｏｓａｎ　ａｎｄ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　Ｄｅａｃｅｌａｔａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｅｘｏｓｋｅｌｅｔｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｒａｗｎ　ＸＵＥ　Ｚｈｉ—ｘｉｎ　’　，ＹＡＮＧ　Ｇｕｉ—ｐｅｎｇ２ＭＡ　Ｘｉａｏ．ｍｅｉ　，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉ—ｑｉｎ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｑｉｎｇｄａｏ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６０７　１．Ｃｈｉｎａ；　２．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｙ　Ｔｈｅｏｒｒｙ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ．Ｑｉｎｇｌａｏ　２６６００３，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｃｈｉｔｉｎ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｅｘｏｓｋｅｌｅｔｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒａｗｎ．Ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ａｌｋａｌｉ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｔｅｍｐｅｒ．　ａｔｕｒｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｅａｃｅｌａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｃｈｉｔｉｎ　ｗｅｒｅ　ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｈｓ　ｓｈｏｗ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｔｈａｎｏｌ　ａｎｄ　ｒａｉｓｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｃａｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｄｅａｃｅｌａｔｉｏｎ　ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｃｈｉｔｉｎ；ｔｈｅ　ｄｅａｃｅｌａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｌｙｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｉｓ　ａ　ｉｆｒｓｔ　ｏｒｄｅｒ　ｒｅａｃｔｉｏｎ；ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｍｉｓｓｉｏｎ　ａｌｋａｌｉ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｃａｎ　ｏｂｔａｉｎ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｄｅａｃｅｌａｔｉｏｎ　ｄｅｇｒｅｅ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｗｅｉｇｈｔ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃｈｉｔｉｎ；ｃｈｉｔｏｓａｎ；ｄｅａｃｅｌａｔｉｏｎ；ａｌｋａｌｉ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　（责任编辑　司丽琴）