慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立与评价

2020年4月

ACTALABORATORIUMANIMALISSCIENTIASINICA

中国实验动物学报

Vol.28　No.2

April2020

张迪,夏艺,范丽,等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立与评价[J].中国实验动物学报,2020,28(2):230-235.AnimSciSin,2020,28(2):230-235.

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慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立与评价

张迪,夏艺,范丽,刘士远,管宇∗

　　【摘要】　目的　通过烟熏法、蛋白酶滴注及两者相结合的方法构建大鼠慢性阻塞性肺疾病(chronic

obstructivepulmonarydisease,COPD)模型,并从炎症水平、影像及病理等方面评价造模效果,对三种建模方法进行比较。方法　使用烟熏、蛋白酶滴注及两者相结合的方法进行COPD大鼠造模,每组大鼠分别为60只、30只、30只,同时设置对照组20只。每周对大鼠进行体重测量。烟熏组及对照组大鼠于造模24h,1、2、4、8、12、16、20、24周,蛋白酶组及蛋白酶+烟熏组大鼠于造模24h,1、2、4、8、12周接受细胞因子检测、Micro-CT检查及病理检查。采用方差分析或Kruskal-WallisH检验进行统计分析。结果　第7周起烟熏组大鼠及蛋白酶+烟熏组大鼠体重增长较对照组明显减缓(P<0.05)。蛋白酶组及蛋白酶+烟熏组大鼠第24h、1、2、4周的白细胞介素-10水平显著低于对照组(P<0.05)。蛋白酶组及蛋白酶+烟熏组大鼠第24h的基质金属蛋白酶-9浓度显著大于对照组(P<0.05)。蛋白酶组、蛋白酶+烟熏组第4周及烟熏组第8周大鼠在Micro-CT图像及病理图像上均可观察到肺气肿改

(海军军医大学附属长征医院,上海　200003)

变。结论　使用烟熏、蛋白酶及蛋白酶+烟熏的方法均可成功构建大鼠COPD模型。Micro-CT可灵敏真实的反应肺部病理改变。

【关键词】　动物模型;肺疾病,慢性阻塞性;体层摄影术,X线计算机

【中图分类号】Q95-33　　【文献标识码】A　　【文章编号】1005-4847(2020)02-0230-06

Establishmentandevaluationofratmodelsofchronicobstructive

pulmonarydisease

(ChangzhengHospitaloftheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200003,China)

Correspondingauthor:GUANYu.E-mail:guan.yu8635@163.com

【Abstract】　

Objective　Toestablishratmodelsofchronicobstructivepulmonarydisease(COPD)withsmoking,

ZHANGDi,XIAYi,FANLi,LIUShiyuan,GUANYu∗

proteaseinstillationandsmoking+proteaseinstillation,andtoevaluateandcompareinflammation,imagingandpathologybetweenthesegroups.Methods　RatmodelsofCOPDwereestablishedwithsmoking,proteaseinstillationandsmoking+proteaseinstillation.Therewere60ratsinthesmokinggroup,30ratsintheproteasegroupand30ratsinthesmoking+proteasegroup.Thecontrolgroupcontained20rats.Bodyweightwasmeasuredeveryweek.Inthesmokingandcontrolweeks1,2,4,8and12.Ratlungtissuessubjectedtocytokinedetection,micro-CTexaminationandpathological

groups,fiveandtworatswereeuthanized,respectivelyat24h,andweeks1,2,4,8,12,16,20and24duringthe

modelingprocess,andintheproteaseandsmoking+proteasegroups,fiveratswereeuthanizedineachgroupat24h,andexamination.Results　Theweightgainofratsinthesmokingandsmoking+proteasegroupwassignificantlyslowerthanthecontrolgroupatweek7(P<0.05).ThelevelsofIL-10at24h,andweeks1,2and4weresignificantlylowerintheat24hwassignificantlyhigherintheproteasegroupandthesmoking+proteasegroupthanthecontrolgroup(P<0.05).

[基金项目]国家自然科学基金(81871321,8137003,81501618,81501470)。

FundedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(81871321,81370035,81501618and81501470).[作者简介]张迪(1993—),女,住院医师,硕士,研究方向:COPD影像诊断。Email:rinzy369@163.com

[通信作者]管宇(1986—),女,主治医师,在读博士研究生,研究方向:胸部影像诊断。Email:guan.yu8635@163.com

proteasegroupandthesmoking+proteasegroupcomparedwiththecontrolgroup(P<0.05).TheconcentrationofMMP-9

中国实验动物学报2020年4月第28卷第2期　ActaLabAnimSciSin,April2020,Vol.28,No.2

231

Emphysemawasobservedonthemicro-CTimagesandpathologicalimagesintheproteasegroupandsmoking+proteasesensitivityandvalidity.

groupatweek4,andinthesmokinggroupatweek8.Conclusions　RatmodelsofCOPDcanbesuccessfullyestablishedbysmoking,proteaseinstillationandsmoking+proteaseinstillation.Micro-CTreflectschangesinlungswithhighConflictsofInterest:Theauthorsdeclarenoconflictofinterest.

【Keywords】　animalmodel;Pulmonarydisease,chronicobstructive;tomography,X-raycomputed

pulmonarydisease,COPD)是一种慢性气道炎性病　慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructive

变,以持续气流受限为特征。据预测,COPD将在

周龄6~7周,由海军军医大学动物中心提供【SCXK(沪)2018-0006】,饲喂设施由中国人民解放军海军医学研究所【SYXK(军)2017-0041】提供。

2020经济负担第五位年成为全球主要死亡原因第三位及世界疾病[1-3]露、燃料燃烧产生的。烟COPD雾、主要由吸烟基因因素等、二手烟暴COPD导致[4]。

恶化,但早期诊断干预可以有效延缓病程呈进行性发展,即使戒烟,病情仍然会进一步。目前缺乏COPD早期诊断及治疗的有效手段,为解决这一问题,需要进一步了解COPD病程中的病理生理变化。COPD动物模型可在短期内呈现出疾病特点,有助于揭示早期COPD发生发展过程中的动态变化。因此,越来越多的学者致力于构建稳定的、与人类病理生理变化类似的动物模型。

被用来制作COPD模型的动物有很多种。其中大鼠可在,如豚鼠、小鼠、大鼠、猴、羊、牛、猪等

[5]

烟熏等诱因下快速构建稳定模型,且呈现出与人类相似COPD的病程,因此被广泛应用

[6-7]

。由于吸烟法中,烟熏模型表现出与人类患者最相似的病理生的主要诱因,在多种COPD动物模型建立方是

理特征,包括气道炎症、肺气肿、气道重塑和肺功能受损等。烟熏模型应用广泛,但造模方法(如实验中香烟种类、数量、烟熏频率、总时间等)缺乏统一标准,使研究间的比较相对困难,实验的可重复性不佳,蛋白酶模型也存在这一不足。不同造模方法的结合同样需要标准指导实验,以满足不同的实验需求。此外,目前缺乏不同造模方法的对比研究,造模方法的选择存在困难。

本研究拟采用烟熏、气管内滴注蛋白酶以及两者结合的方式分别建立COPD大鼠模型,对比三者的造模效果,以期为COPD的研究提供稳定可靠的建模方法。

1　材料与方法

1.1.1　1.1　材料雄性实验动物

II级Wistar大鼠140只,体重(190±10)g,

饲养环境温度控制在(22±2)℃,正常饲养7d后进行实验。随机分为4组:⑴正常对照组n=20;⑵烟熏组n=60;⑶蛋白酶组n=30;⑷蛋白酶+烟熏组n1.=1.30。

2　弹性蛋白酶试剂与仪器

(南京奥多福尼生物科技有限公

司,中国),香烟(大前门,焦油含量10mg/根),1%戊巴比妥钠(天津兰洪新能源科技有限公司,CAS:

57技发展有限公司-33-0),4%多聚甲醛溶液,CAS:30525(-武汉楚江浩宇化工科89-4),0.9%氯化钠溶液(华润双鹤药业股份有限公司,CAS号:7647-CAS14-5),号64无水乙醇-17-5),(纯净水等上海处泰化工科技有限公司。,

微型计算机D7K67PA(惠普,美国),SCANCO1.uCT802　方法

Micro-CT(SCANCOmedicalAG,瑞士)。

1.2.1　每周测量大鼠的体重体重测量,监测各组大鼠体重动态

变化规律。

1.2.2　烟熏组使用建立模型PAB-S200被动吸烟动物染毒系统

(造模烟熏箱大小。烟熏过程中使用试管及抽吸装置对大鼠进:80cm×60cm×58cm)及香烟进行行间歇烟雾暴露,模拟人类吸烟过程中烟雾暴露模式。每次烟熏同时点燃香烟20根,直至完全燃烧且烟雾基本散尽,共持续40min,每天烟熏2次,两次间隔时间不少于4h,一周烟熏6d。

将蛋白酶组大鼠颈部皮肤及肌肉分离,暴露主气管,使用注射器向主气管内滴注弹性蛋白酶一次,剂量为50IU/100g。蛋白酶+烟熏组将气管滴注蛋白酶与烟熏相结合,气管内滴注弹性蛋白酶(50熏处理IU/。

100g)后第二天起,按烟熏组的方法进行烟232

1.2.3　标本制备

中国实验动物学报2020年4月第28卷第2期　ActaLabAnimSciSin,April2020,Vol.28,No.2

鼠体重增长值与对照组出现差异(P<0.05)。蛋白酶组与对照组体重增长无显著差异,但蛋白酶组大2.2　细胞因子

鼠1~4周体重增长较对照组稍缓慢。

本研究中蛋白酶组及蛋白酶+烟熏组大鼠第

烟熏组于烟熏24h,1、2、4、8、12、16、20、24周

处理大鼠各5只,对照组于对应时间处理大鼠各2只,蛋白酶+烟熏组于烟熏24h,1、2、4、8、12周处理大鼠各5只,蛋白酶组于相应时间处理大鼠各5只。经气管向两侧肺内反复缓慢注入并抽回生理盐水共4.5mL左右,进行支气管肺泡灌洗。离体肺标本用4%多聚甲醛溶液固定48h后进行乙醇梯度脱水获得干燥肺标本(图1)。

24h、1、2、4周IL-10水平显著低于对照组(P<0.05,图4)。蛋白酶组及蛋白酶+烟熏组第24h

MMP-9浓度显著大于对照组(P<0.05),此后,蛋白酶组及蛋白酶+烟熏组MMP-9浓度与对照组虽无图1　脱水后的干燥肺标本

Figure1　Driedlungspecimenafterdehydration

1.2.4　肺标本行标本Micro-CTMicro-CT检查及图像分析检查。Micro-CT　

扫描参数:

管电压70kV,管电流144μA,分辨率18μm。主观评价COPDCT表现图像是否出现肺大泡,并记录出现时间。

,肺密度减低,炎症等1.2.5　标本经石蜡包埋后标本病理学检查及图像分析HE,每个肺叶选取3张切片,行

间隔变窄染色,、镜下观察标本是否出现肺泡扩张断裂等改变,并记录出现时间。

、融合,肺泡灌洗液1500r/min离心10min,留取上清液10)。采用大鼠白细胞介素-MMP-9)ELISA及基质金属蛋白酶-9(matrix10(interleukin-10,IL-公司)检测细胞因子试剂盒IL-10、MMP-9(深圳欣博盛生物科技有限metalloprotein-9,水平。

1.3　统计学分析

采用SPSS21.0软件。比较组间体重及细胞因子差异时,若数据分布符合正态分布,采用方差分析;否则采用Kruskal-WallisH检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　体重

对4组大鼠进行体重测量,结果如图2、3所示。与对照组相比,烟熏组大鼠及蛋白酶+烟熏组大鼠体重增长缓慢,第7周起烟熏组、蛋白酶+烟熏组大

显著差异,但较对照组稍高(图5)。烟熏组及对照组间IL-10及MMP-9未见明显差异。

2.3　Micro-CT及病理　

对照组Micro-CT图像及病理图像均未见明显异常(图6a),蛋白酶组、蛋白酶+烟熏组第4周及烟熏组第8周Micro-CT图像均可见肺大泡,局部肺组织密度减低6b1-d1红色箭头标注部分,部分可见炎症);,肺内病变分布均匀病理图像均可见肺泡

(图扩张(果与病理结果一致图6b2-d2,间隔变窄黑色箭头标注部分,部分肺泡间隔断裂。

)。四组,肺泡融合等Micro-CT结图2　烟熏组大鼠及对照组大鼠体重变化Figure2　Weightgainchangesinthesmokinggroup

andthecontrolgroup

图3　蛋白酶组、蛋白酶+烟熏组及对照组大鼠体重变化Figure3　Weight+gainchangesintheproteasegroup,thesmokingproteasegroupandthecontrolgroup

中国实验动物学报2020年4月第28卷第2期　ActaLabAnimSciSin,April2020,Vol.28,No.2

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图4　四组大鼠IL-10水平变化

Figure4　ChangesofIL-10concentrationsinthefourgroups

图5　四组大鼠MMP-9水平变化

Figure5　ChangesofMMP-9concentrationsinthefourgroups

注:a:正常对照组;b:烟熏组;c:烟熏+蛋白酶组;d:蛋白酶组。红色箭头:肺大泡,局部肺组织密度减低,可见炎症;黑色箭头:肺泡扩张,间隔变窄,部分肺泡间隔断裂,肺泡融合。

图6　四组大鼠Micro-CT及病理表现(HE染色,对照组×200,其他×400)

Note.a,Controlgroup.b,Smokinggroup.c,Smoking+proteasegroup.d,Proteasegroup.Redarrow:pulmonarybullous,reduceddensityoflungandinflammation.Blackarrow:alveolarectasia,alveolarfusionandalveolarseptaldestruction.

Figure6　Micro-CTimagesandphotographsofHE-stainedlungtissueunderopticalmicroscopes(controlgroup,×200;others,×400)

3　讨论

理想的动物模型需表现出人类疾病的特点,尽可能使模型发病机理与人类疾病同源,此外还需满足模型制备可重复性高,动物成活率高等条件。目前尚无理想COPD动物模型。啮齿类动物、猴、羊、狗等均可用于COPD动物模型制备,其中大鼠因基因、行为特征及易进行实验干预的特点成为建造COPD模型,模拟人类COPD病程的常用动物。

大鼠是否适用于COPD造模仍存在争议。有研

常用的烟熏、气管滴注蛋白酶及两者相结合的造模方法。烟熏造模效果与香烟类型,烟雾暴露方法及暴露时间有关,但三者均无统一标准[13-14]。Churg等[15]研究表明产生肺气肿需6个月,而Leberl等[9]

只需2个月。本研究采用大前门香烟(焦油含量每根10mg)及全身暴露的模式对大鼠进行烟熏。蛋白酶—抗蛋白酶失衡学说是COPD发病机制的经典学说,基于此,弹性蛋白酶被广泛应用于COPD模型制作。本研究采用气管内滴注弹性蛋白酶(南京奥多福尼生物科技有限公司)的方法进行造模。应[16-17]。其在COPD病程中的变化过程及作用目前仍存在争议。曾华东等[18]对支气管肺泡灌洗液细胞进行培养,并测定细胞培养上清液中IL-10含量,结果表明COPD组与对照组无明显差异。有研究[19]认为COPD组与正常对照组间血清IL-10水平亦无显著差异。但也有研究[20]发现与正常对照组

有研究表明IL-10分布广泛,可抑制炎症反

究报道大鼠不易诱发产生COPD[8],也有研究显示,仅需2个月的烟熏就可观测到大鼠的肺气肿改变[9]。人类对COPD并不易感,需多年的烟熏才会造成COPD。因此,造模时间并非选择造模动物的决定性因素。

COPD造模方法有很多,如烟熏、蛋白酶或脂多

糖气管滴注、基因水平造模等[10-12]。本研究选择较

234

中国实验动物学报2020年4月第28卷第2期　ActaLabAnimSciSin,April2020,Vol.28,No.2

相比,COPD患者血清IL-10水平下降,说明IL-10参与COPD炎症反应。梁柱等人发现肺泡灌洗液中COPD组IL-10水平明显高于对照组[21]。本研究对烟熏组及对照组的支气管肺泡灌洗液IL-10水平进行测定,发现两组间无显著差异。而蛋白酶组及蛋白酶+烟熏组大鼠24h、1、2、4周IL-10水平显著低于对照组。这可能因为24h~4周蛋白酶产生炎症导致IL-10水平下降,随后蛋白酶逐渐降解,炎症消退。因存在检测误差或试剂盒灵敏度不够可能,不白酶滴注法。

变,表明Micro-CT对肺部改变非常灵敏,可用于无创动态监测肺部病理变化。总之,本研究表明使用烟熏、蛋白酶及蛋白酶+烟熏的方法均可成功构建大鼠COPD模型。烟熏大鼠模型可更好的模拟人类COPD病程,蛋白酶模型更加快速高效,而蛋白酶+烟熏模型更适于快速模拟中重度COPD。Micro-CT可灵敏真实的反应肺部病理改变。

Micro-CT与病理同步观测到模型大鼠肺部改

能排除烟熏导致炎症可能。MMP-9为促炎细胞因子,可分解气道和肺组织的细胞外基质及基底膜,参与气道和肺组织的重塑过程。Li等[22]分析923名COPD患者及641名健康受检者细胞因子水平,发现COPD患者血清MMP-9水平显著高于健康对照组MMP-9。Aneta与对照组水平亦高于健康对照组等[23]的研究表明COPD患者痰液中MMP-9水平虽无显著差异。本研究中烟熏组,但从第8周开始MMP-9,烟熏组白酶组及蛋白酶存在升高趋势MMP-9水平均较对照组高+烟熏组,支持烟熏导致气道炎症。表明烟熏组24h的MMP-9浓度显著。蛋大于MMP-9对照组,此后,蛋白酶组及蛋白酶+烟熏组高。细胞因子检测结果表明蛋白酶致炎作用较烟浓度与对照组虽无显著差异但较对照组稍熏显著,可诱导大鼠产生急性炎症;烟熏诱导的炎症发展缓慢,与人类COPD更相似会对COPDCOPD患者常存在体重减轻。患者肌肉功能本研究对大鼠体重进行检测、健康状态甚至预后产生,。

而体重减轻可能

影响

[24-25]

组大鼠及蛋白酶+烟熏组大鼠体重增长较对照组缓,发现烟熏

慢,这与临床患者表现一致。COPD患者体重减轻原因很多,如炎症[26],肌肉修复能力受损[27]血症及二氧化碳潴留引起厌食

[28]

,低氧COPDCT是诊断COPD的重要手等段。

,可直接观察

肺部损形态学改变害[29],并在吸烟者肺功能受损前发现别,可无创、清晰的观测样本内部显微结构。其中Micro-CT分辨率达到,微展示疾米级病动态过程。本研究使用Micro-CT与病理联合评估大鼠肺部改变,发现第4周蛋白酶组、蛋白酶+烟熏组及第8周烟熏组出现COPD表现,同时4周蛋白酶+烟熏组Micro-CT及病理改变程度均高于蛋白酶组。说明烟熏法、蛋白酶气管滴注法及两者相结合构建大鼠COPD模型分别需8周、4周及4周。此外,蛋白酶+烟熏法诱导COPD病变程度高于蛋

致谢　感谢于志峰博士(上海市第九人民医院)提供图像后处理帮助。

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