HIF-1а及VEGF在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的表达及相关性

发表时间：2013-08-05T09:13:08.950Z 来源：《中外健康文摘》2013年第26期供稿 作者： 米明珊 官众[导读] 在大鼠脊髓缺血再灌注脊髓组织中均表达增加，且HIF-1α因子、COX-2因子表达存在相关性。

米明珊 官众（青海大学附属医院脊柱外科 青海西宁 810000）

【摘要】 目的 研究缺血再灌注损伤大鼠脊髓组织中缺氧诱导因子-1α（HIF-1а）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达相关性以及两者在腰椎间盘退变过程中的意义。方法 3O只SD大鼠随机分为实验组(A组，15只)和对照组(B组，15只)，每组各分为6h、12h、48h组，每亚组各5只。采用Nas1und腹主动脉阻断方法建立脊髓缺血再灌注损伤手术模型。分别获取实验组、对照组不同时间点脊髓组织，采用免疫组化技术，显示出HIF-1α因子、VEGF因子的表达状况，并描述缺血再灌注脊髓组织中HIF-1α因子与VEGF因子的表达相关性。结果 HIF-1α因子、VEGF因子在正常脊髓中表达很少或几乎不表达，而在缺血再灌注脊髓组织中二者表达均明显增加。HIF-1α因子和VEGF因子在缺血再灌注脊髓组织中表达程度正相关（p<0.01,r=0.625）。结论 在大鼠脊髓缺血再灌注脊髓组织中均表达增加，且HIF-1α因子、COX-2因子表达存在相关性。

【关键词】 脊髓 缺血再灌注 血管内皮生长因子 缺氧诱导因子-1α

脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia reperfusion injury，SCII)是原发性脊髓损伤的继发性损害，关于SCII的病理机制是目前国内外研究的热点问。近年来随着研究的深入，学者们发现血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor ，VEGF）作为一种血管生成肽，在脊髓缺血再灌注损伤后，通过改善局部微循环，可对脊髓神经起到保护作。另一方面大量研究表明因肿瘤增长迅速造成的局部缺血缺氧和营养的缺乏，促使缺氧诱导因子-1ɑ（Hypoxia- inducible factor-1α，HIF-1ɑ）、VEGF两种因子表达增加，而这两种因子又可相互作用，对局部新生血管形成产生促进作用。本研究通过建立大鼠缺血再灌注损伤模型，在缺血再灌注后不同时间点，通过免疫组化法联合检测HIF-1ɑ、VEGF的在缺血再灌注中的表达情况，并通过统计学方法研究二者之间的表达的相关性， 一、材料和方法 1.试剂

试剂：HIF-1α多克隆抗体(santa cruz )、VEGF多克隆抗体（北京博奥森）、一抗稀释液（北京博奥森）,即用型S-P超敏试剂盒（福州迈新）

2.方法

30只健康雄性SD大鼠随机分为实验组(A组，15只)和对照组(B组，15只)，每组各分为6h、12h、48h组，每亚组各5只。实验组采用Nas1und腹主动脉阻断方法建立脊髓缺血再灌注损伤手术模型。于左侧肾动脉分权下方放置阻断带阻断腹主动脉，以阻断下方动脉无搏动为标准。对照组麻醉和手术操作同实验组，但开腹只放置阻断带，而不阻断腹主动脉。分别获取实验组、对照组不同时间点脊髓组织，置于100ml/L中性溶液，于4℃冰箱固定24h。石蜡包埋制成蜡块，连续切片，制成4μm病理切片。HIF-1α、VEGF的表达均采用SP免疫组化技术测定：烤片，二甲苯、乙醇梯度脱蜡水化，抗原修复，滴加内源性过氧化酶阻断剂，滴加一抗，4℃冰箱过夜，滴加二抗，滴加链霉素抗生物素—过氧化酶溶液，DAB显色，苏木素复染，烘片、封片。 3.结果的判定

用已知阳性切片作为阳性对照,用PBS代替一抗作阴性对照:①HIF-1α、VEGF因子以胞质、胞膜黄染为阳性判定标准，选取5个高倍镜视野，计算HIF-1α、VEGF表达阳性细胞个数；②计数缺血再灌注脊髓组织中HIF-1α、VEGF因子表达阳性细胞所占百分比（高倍镜下阳性细胞/所有细胞×100%），并根据所占百分比及着色强度综合制定免疫组化半定量评分标准:（1）阳性细胞<1％ 0分；1％-10％ 1分；10％-50％ 2分；51％-80％ 3分；>80％ 4分。（2）着色强度计分：弱，1分；中,2分；强,3分。两个分值相加即为最终判定结果：1分（-）；2-3分（+）；4-5分（++）；6-7分（+++）。 4.统计学分析

所有统计学分析均采用SPSS17.0统计软件完成，计量数据用 -x±S表示，两组样本比较，方差齐采用t检验，方差不齐采用tˊ检验。HIF-1α与VEGF的相关性分析采用Spearman等级相关分析。以P <0.05表示差异有统计学意义。 二、结果

1.光镜检测结果

①实验组：随着缺血再灌注时间延长，可见前角运动神经元固缩，变小。细胞核萎缩，偏向一侧，核仁欠清晰。尼氏体染色较浅，结构松散，排列相当紊乱，并可见位于细胞周边部的尼氏体。

②对照组：前角运动神经元轮廓清析，细胞核位于，细胞核核仁清晰可见。尼氏体网班状排列于核周，胞浆均匀。 2.免疫组化结果

实验组缺血再灌注脊髓组织中，HIF-1α在6h组阳性细胞计数为3.2±0.8，12h组阳性细胞计数11.4±1.7，48h组为2.4±0.9；对照组脊髓组织中，HIF-1α在6h组阳性细胞计数为0，12h组阳性细胞计数0，48h组为0，两组不同时间点间比较，差异具有统计学意义，P＜0.05。（见表1）

表1 缺血再灌注组与对照组不同时间点HIF-1α表达状况

实验组缺血再灌注脊髓组织中，VEGF在6h组阳性细胞计数为16.1±2.3，12h组阳性细胞计数32.1±3.7，48h组为38.1±4.4；对照组脊髓组织中，VEGF在6h组阳性细胞计数为8.1±1.3，12h组阳性细胞计数8.7±1.5，48h组为8.4±1.5，两组不同时间点间比较，差异具有统计学意义，P＜0.05。（见表2）

表2 缺血再灌注组与对照组不同时间点VEGF表达状况

3.相关性分析

在缺血再灌注组脊髓组织中，HIF-1α与VEGF的表达呈正相关，相关系数R=0.652，P=0.008，结果具有统计学意义。（见表3） 表3 缺血再灌注脊髓内HIF-1ɑ、VEGF的表达状况n=15

三、讨论

脊髓缺血再灌注损伤(Spinal cord ischemia reperfusion injury；SCII)是脊柱外科和神经科学领域中常见的继发性脊髓损伤之一，由Allen 在1911年首先描述，是脊柱外科术后的的一种继发性神经功能损伤，虽然发生率低，但是一旦发生，后果较为严重，可导致截瘫、全瘫，甚至死亡。脊髓神经元是对缺血缺氧极其敏感的神经细胞，损伤后重新得到血液的再灌注是防止损伤使其存活的必要措施。但近事实上经过一定时间缺血的脊髓神经元，尽管得到血液再灌注后却出现了明显的脊髓神经功能障碍,甚至出现不可逆性迟发性脊髓神经元死亡，这种现象后来得到证实为脊髓存在缺血再灌损伤。

建立标准的、重复性好的脊髓动物缺血再灌注模型对理解缺血再灌注损伤的病理生理机制，至关重要，脊髓缺血性损伤模型的建立按阻断方式可分为直接阻断主动脉和选择性阻断或结扎脊髓供血动脉等方法。我们采用Nas1und腹主动脉阻断方法不仅存在一定时间的缺血，在结束后阻断后还存在再灌注过程，损伤机制与临床发生脊髓缺血再灌注损伤过程相似相似，且操作简单、结果可靠。

VEGF作为一种强的血管生成肽，能调节血管生成和血管的通透性，在脊髓缺血损伤的病理生理过程中起着重要作用。研究表明，大鼠脊髓损伤后，可以检测到损伤区内VEGF蛋白表达的变化。细胞凋亡是脊髓缺血再灌注损伤发生的重要原因，研究表明VEGF可明显抑制脊髓损伤后的细胞凋亡。脊髓损伤后，可启动Ｂcl-2基因家族参与凋亡，其中Ｂcl-2蛋白能抑制细胞凋亡，Bax蛋白促进细胞凋亡。VEGF可以使Ｂcl-2蛋白表达明显增多，Ｂax蛋白表达减少。从而减少细胞凋亡，缓解继发性脊髓损伤。另一方面，脊髓损伤后可触发自由基和一氧化氮大量表达，诱发细胞凋亡。内源性谷胱甘肽在脊髓损伤后可起到抑制细胞凋亡、保护神经的作用。VEGF可以提高谷胱甘肽的水平，降低一氧化氮的水平，从而减少其介导的细胞凋亡及其组织损伤。

HIF-1α是由Samenza和Wang发现的一种蛋白质, 由一个α亚基和一个β亚基构成, HIF-1α是唯一的氧调节亚单位，在常氧下极不稳定,HIF-1是机体细胞适应低氧的重要转录调节因子, 与一系列缺氧反应靶基因上的特定结合位点缺氧反应元件(HRE) 结合，从而启动靶基因的转录表达。随着肿瘤的不断生长,体积增大，血供不足发生，缺氧坏死，诱导HIF-1α过度表达，而HIF-1α在基因水平上直接VEGF的表达，从而诱导新生血管生成，使肿瘤细胞可以继续生长和向远处转移。

通过研究我们发现，在脊髓缺血再灌注后HIF-1α、VEGF因子表达均增加，且二者呈正相关关系，我们推测在脊髓缺血再灌注过程中，随着脊髓缺血、缺氧的发生，可诱导HIF-1α的表达,而活化的HIF-1a可与靶基因上的特定结合位点结合, 形成转录起始复合物, 从而启动靶基因转录促使相应的蛋白表达产物VEGF表达增加，而后者有可作用于细胞表面的VEGFR-1和VEGFR-2受体, 从而对缺血再灌注后脊髓组织起到保护作用。因此联合检测HIF-1α、VEGF可为我们治疗脊髓缺血再灌注损伤的发生提供一个新途径。通过增强HIF-1α的表达或转录活性,而增加HIF-1α与VEGF的表达, 减少脊髓缺血再灌注损伤所造成的不良后果。

参 考 文 献

[1] Abumiya T，Lucero J，Heo J H，et a1.Activated microvessels express vascular endothelial growthfactorandintegrin alpha(v) beta 3during focal cerebral ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab，1999，19(9)：1038—1050.

[2] 王小莉,万毅新,张启昆.缺氧诱导因子-1α与血管内皮生长因子在非小细胞肺癌中的表达及意义[J].肿瘤防治研究.2005.8(32):487-4. [3]Shunqing Zuo,Yanmei Ji,Jianjun Wang,Jialong Guo. Expression and clinical implication of HIF-1α and VEGF-C in non-small cell lungcancer[J]. Huazhong University of Science and Technology.2008.6(28):674-676.

[4]Hongzhen Zhang,Yazhen Wang,Ning Xu,Shuchai Zhu,Bin Liu.Expression and clinical significance of HIF-1α,VEGF and Survivin inesophageal squamous cell arcinoma[J]. Spine.2007.4(6):339-344.

[5]Wang W ，W u R，Sun G，et a1.Expression of VEGF-C andVEGF-D in gastric carcinoma and its relationship with lymph nodemetastases[J].Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2010，35(4)：335.

[6] Cimpean AM，R丑ica M，Suciu C，et a1.Vascular endothelialgrowth factor A(VEGF A)as individual prognostic factor in invasivebreast carcinoma[J].Rom J Morphol Embryol，2008，49 (3)：303-308.

[7]Gratzinger D，Zhao S，Marinelli RJ，et a1.Micmvessel density and expression of vascular endothelial growth factor and its receptorsin difuse large B-cell lymphoma subtypes[J].Am J Pathol，2007,170(4)：1362-1369.

[8]Fan LH，Wang KZ，Cheng B.Effects of Ginkgo biloba extract on lipid peroxidation and apoptosis after spinal cord ischemia／reperfusion in rabbits[J].Chin J Traumatol， 2006，9(2)：77—81.

[9]Logan MP，Parker S，Shi R.Glutathione and ascorbic acidenhance recovery of Guinea pig spinal cord white matter followingischemia and acrolein exposure[J].PathobiologY，2005，72(4)：171-178.

[10] S0ndel1 M，Lundborg G，Kanje M.Vascular endothelial growth factor has neurotrophicactivity and stimulates axonal outgrowth，enhancing cell survival an d Schwann cel proliferation in the eripheral nervous system[J].J Neurosci，1999，19(14)： 5731-5740.

[11] J SchratzJ～rger P，Schratzberger G，Silver M，et a1.Favorableefect of VEGF gene transfer on ischemic pe ripheral neuropa thy[J].Nat Med，2000，6(4)：405-413.

[12] Wang GL,Semenza GL.A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin geneenhancer at a site required for transcriptional activation[J].Mol Cell Biol.1992.12(12):5447-5454.

[13] Semenza GL.O2-regulated gene expression:transcriptional control of cardiorespiratory physiology by HIF-1ɑ[J].J ApplPhysiol.2004.96(3):1173-1177.