rDNA_ITS序列分析在真菌鉴定中的应用

󰀁论著󰀁

rDNA-ITS序列分析在真菌鉴定中的应用

燕勇,李卫平,高雯洁,沈志英,王恒辉,陈黎霞

(浙江省嘉兴市疾病预防控制中心,浙江嘉兴󰀁314050)

[摘要]󰀁目的:通过对3株真菌的rDNA-ITS序列进行分析,以探讨、说明基于核糖体RNA基因(即rDNA)内转录间隔区(InternalTranscribedSpacer,ITS)的多态性的序列分析(rDNA-ITS序列分析)在真菌鉴定中的应用。方法:通过PCR

扩增与测序的方法测得待检真菌菌株的rDNA-ITS序列,从GENBANK获取相似序列,使用BLAST和DNAMAN工具对rDNA-ITS序列进行比对分析。结果:1号真菌菌株与Xylarialessp󰀁LM40(属炭角菌目)同源性高,但尚不能鉴定到具体的属、种;2号真菌菌株可鉴定到种,为草酸青霉Penicilliumoxalicum;3号真菌菌株可鉴定到种内组水平,为*滑假丝酵母III组(最新命名为Candidametapsilosis)。结论:相对于传统的真菌形态学鉴定方法,rDNA-ITS序列分析用于真菌鉴定更客观、省时、简便、快速,但目前也存在一定的应用(受基因库的完善程度、高度同源性序列的多少以及具体物种ITS区的可变程度等影响)并不能鉴定出所有真菌,宜与传统的形态学鉴定方法相结合用于真菌鉴定。[关键词]󰀁rDNA;内转录间隔区(ITS);PCR;测序;真菌;鉴定[中图分类号]󰀁R446󰀁5󰀁󰀁󰀁󰀁[文献标识码]󰀁A󰀁󰀁󰀁󰀁[文章编号]󰀁1004-8685(2008)10-1958-04

ApplicationofrDNAITSsequenceanalysisinfungusidentification

YanYong,LiWei󰀁ping,GaoWei󰀁jie,ShenZhi󰀁ying,WangHeng󰀁hui,ChenLi󰀁xiao(JiaxingCenterforDiseaseControlandPrevention,Jiaxing314050,China)

[Abstract]󰀁Objective:TointroduceandilluminatetheapplicationofrDNAITSsequenceanalysisinfungusidentificationonbasisofsequenceandlengthpolymorphismsofinternaltranscribedspacer(ITS)inribosomalRNAgene(rDNA)󰀁Methods:Thethreependingfungusstrains󰀁rDNAITSsequencestestedbyPCRamplificationandsequencingmethodswereanalyzedandcom󰀁paredwithsimilarsequencesfromGENBANKbyNCBIBLASTonlinetoolandDNAMANsoftware󰀁Results:No󰀁1fungusstrainhadahighhomologywithXylarialessp󰀁LM40,butwasnotyetidentifiableongenusorspeciesleveloftaxonomicclassifica󰀁tion󰀁No󰀁2strainwasidentifiedasPenicilliumoxalicum,agenuslevel󰀁No󰀁3strainwasidentifiedasCandidametapsilosis,newdesignationofCandidaparapsilosisgroupIII,agrouplevelinspeciesrelatively󰀁Conclusion:Comparedwiththetraditionalmor󰀁phologicalidentificationmethods,therDNAITSsequenceanalysisismoreobjective,time-saving,convenient,andfastforfun󰀁gusidentification,butwithsomeappliedlimitscurrently󰀁Dependedontheperfectiondegreeofgenedatabase,thenumberofhigh-degreehomologysequence,thevariabilityextentofITSregionofbiologicalindividualsandsoonitcanbeapplied󰀁Then,itdoesnotidentifyallfung,iandshouldbecombinedwiththetraditionalmorphologicalidentificationmethodsforfungusidentification󰀁[Keywords]󰀁rDNA;Internaltranscribedspacer(ITS);PCR;Sequencing;Fungus;Identification󰀁󰀁真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28SrDNA、5SrDNA、18SrDNA和5󰀁8SrDNA4种,它们在染色体上头尾相连、串联排列,相互之间由间隔区分隔。其中18S、5󰀁8S和28SrDNA基因组成一个转录单元(图1),三者高度保守,适合于较高等级水平的生物群体间的系统分析[1],其间的间隔区为内转录间隔区(InternalTranscribedSpacer,ITS),包括ITS1及ITS2两部分,由于进化相对迅速而具多态性,因而适合于等级水平较低的系统学研究。

真菌种类繁多,仅依靠形态、生化等表型特征来鉴定真菌既需要丰富的真菌鉴定工作经验又需要较长的检验时间,尤

[基金项目]󰀁浙江省档案局科研项目(2007-9)

[作者简介]󰀁燕勇(1974-),男,学士,主管技师,主要从事微生

物检验工作。

其对于那些生长条件特殊、形态相似的菌株要通过传统的表型特征鉴定方法来加以鉴别显得非常困难。而基于rDNA-ITS的多态性(包括长度多态性和序列多态性)的序列分析,由于可以从不太长的核酸序列中获得相对足够的信息用来反映生物亲缘关系与分类情况,因而成为真菌分类及鉴定研究的

热点,目前已广泛应用于真菌的属种间[2,3]及部分种内组群水平[4,5,

15]

的系统学研究。本文通过PCR扩增与测序的方法对

ITS序列分析在真菌的分子生物学鉴定中的应用作初步的介绍与分析。

1󰀁材料和方法1󰀁1󰀁rDNA-ITS扩增引物

ITS的引物选择与扩增的目标区间有关(表1),单独分析ITS1区、ITS2区序列可以研究亲缘关系较近的属种或群组之

中国卫生检验杂志2008年10月第18卷第10期󰀁ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,Oct2008;Vol18󰀁No101959

间小范围、低水平的序列变化;若需要相对足够的序列信息用于未知真菌的系统分类学研究或鉴定未知真菌的属种,可对于整个ITS区设计引物,由于真菌全长ITS区序列(图1)包含了其两端的18SrDNA、28SrDNA的部分序列和中间的ITS1区、5󰀁8SrDNA、ITS2区的完整序列(长度300~1000bp,真菌通常600bp左右)拥有相对丰富的信息,因而全长序列的ITS分析在真菌分子生物学鉴定中比较常用。

表1󰀁真菌rDNA-ITS通用扩增引物

PrimerITS1ITS2

*ITS3

表2󰀁rDNA-ITSPCR的反应组成

Amount(󰀁l)5440󰀁50󰀁50󰀁252Upto50

Components

PCRBuffer(10󰀁,Mg2+free)MgCl2(25mM)dNTP(2󰀁5mMeach)

Primer-F(20󰀁M),usingITS1Primer-R(20󰀁M),usingITS4TaqDNApolymerase(5U/󰀁l)

Seqence(5󰀁to3󰀁)TCCGTAGGTGAACCTGCGGGCTGCGTTCTTCATCGATGCGCATCGATGAAGAACGCAGCTCCTCCGCTTATTGATATGC

Length(bp)

19202020

DNAtemplate(100~300ng/󰀁l)dH2O

ITS4󰀁󰀁*

1󰀁4󰀁5󰀁rDNA-ITS测序与分析󰀁将扩增出来的目的核酸片段

送上海生工生物工程技术服务有限公司纯化后进行测序。将测得的序列提交美国NCBI的GENBANK获取对比指标靠前的20个相似序列,通过BLAST工具和DNAMAN软件进行比对分析并以Neighbor-Joining方法构建系统发育树。2󰀁结果

2󰀁1󰀁PCR扩增结果

使用两种真菌DNA基因组提取试剂盒(图中以a、b示)提取1、2、3号真菌菌株DNA,其rDNA-ITSPCR产物经凝胶电泳均能扩增出目的条带(图2),扩增产物大小均在500~750bp之间。

ITS3为ITS2的反补序列

图1󰀁真菌rDNA转录区和相关引物

1󰀁2󰀁菌株来源

本文例举档案库房环境中采样所分离得到的1号、2号、3

号菌株用于ITS序列分析说明。通过形态学鉴定,可以初步鉴定为未知真菌、青霉和酵母菌。真菌形态学鉴定方法非讨论重点,在此不作叙述。1󰀁3󰀁主要试剂

真菌DNA基因组提取试剂盒:BiospinFungusDNAGe󰀁nomeExtractionKit(杭州Bior,Cat#BSC14M1),UniversalDNAGenomicExtractionKitVer3󰀁0(大连TaKaRa,Cat#DV811A);PCR扩增试剂盒:TaKaRaPCRAmplificationKit(Cat#DR011)。1󰀁4󰀁方法与步骤

1󰀁4󰀁1󰀁增菌培养󰀁使用沙氏液体培养基对待检菌株进行振荡培养(28󰀁48~72h)收获菌丝体以备核酸提取。沙氏液体培养基配制:葡萄糖40g,蛋白陈10g,加无离子水至1000m,l自然pH值,121󰀁20min灭菌后以3ml试管分装备用。1󰀁4󰀁2󰀁真菌DNA基因组提取󰀁取真菌培养液离心后加适量dH2O充分研磨破碎,选用Bior和TaKaRa的上述两种商品化真菌核酸提取试剂盒进行DNA提取。

1󰀁4󰀁3󰀁核酸纯度与浓度测定󰀁取一定量的DNA提取液进行一定倍数的稀释后,在260、280与320nm下分别测定OD值,以(OD260-OD320)/(OD280-OD320)计算核酸纯度,自然界核酸纯度范围为1󰀁6-2󰀁0,一般以1󰀁8󰀁0󰀁2为宜[6];核酸浓度(ng/󰀁l)󰀁50󰀁(OD260-OD320)/L󰀁D(L为光径长度cm,

[6]

D为稀释倍数),根据结果将核酸浓度稀释至适合的PCR用模板浓度100~300ng/󰀁。l1󰀁4󰀁4󰀁rDNA-ITS扩增󰀁以表2所示的PCR反应组成,按反应条件(94󰀁2min;94󰀁30s,59󰀁30s,72󰀁90s,35Cycles;72󰀁7min)扩增全长序列的ITS。将PCR产物用1%凝胶进行电泳30min(100V),使用0󰀁5󰀁g/mlEB或3󰀁GelRed进行后染30min,然后在凝胶成像仪上进行显影成像,观察是否扩增出目的条带。图2󰀁两种提取试剂盒所得3株真菌菌株的rDNA-ITSPCR产物

M:WideRangeDNAMarker(100-6000);a:UsingBioer

BiospinFungusDNAGenomeExtractionKit;b:UsingTaKaRaUniversalDNAGenomeExtractionKit

2󰀁2󰀁rDNA-ITS序列测序与比对结果

3株真菌与从GENBANK获取的相似序列经DNAMAN软

件进行比对分析并构建N-J系统发育树(图3)。根据系统发育树并结合各比对指标确定距离与同源性均具有较大鉴定意义(Identfication)的比对序列(表3~5)。对于1号真菌菌株,该菌株在GENBANK中的相似序列较少,具有鉴定意义的是序列EF060424󰀁1(Xylarialessp󰀁LM40),与其同源性最高(Blast的Maxident为97%,DNAMAN的Homology为96󰀁2%),可认为该菌株在分类学上与Xylarialessp󰀁LM40(炭角菌目)亲缘关系最近,但尚不足以鉴定到具体的属、种;2号真菌菌株,较有鉴定意义的是序列EU434727󰀁1(Penicilliumoxalicum)、DQ401541󰀁1(Penicilliumoxalicumstrain083135),该菌株高度相似序列较多,与DQ401553󰀁1(Penicilliumterrestrestrain094303土生青霉)、DQ267827󰀁1(PenicilliumexpansumstrainF3

1960中国卫生检验杂志2008年10月第18卷第10期󰀁ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,Oct2008;Vol18󰀁No10

扩展青霉)、EF550979󰀁1(Penicilliumjanthinellumisolate

表5󰀁2号真菌菌株rDNA-ITS序列(LCL|28807)的有意义的比对序列

Max

Accession

Description

score

EU484054󰀁1

CandidametapsilosisstrainL7685

AY391844󰀁1

CandidametapsilosisstrainCBS2916

EF193072󰀁1

Candida

metapsilosisvoucherMCCC2E00290

EF190228󰀁1

CandidametapsilosisstrainZhuan112

878

878

96%

0

99%

97󰀁8%

0󰀁022

878

878

96%

0

99%

98󰀁6%

0󰀁014

900

900

98%

0

99%

98󰀁8%

0󰀁012

883

scorecoverage883

98%

value0

ident98%

98󰀁6%

0󰀁014

Total

Query

E

Max

Homology

Distance

MTCC65微紫青霉)的同源性Homology均高于95%(Max

ident均大于97%);3号真菌菌株,较有鉴定意义的是序列EU484054󰀁1(CandidametapsilosisstrainL7685)、AY391844󰀁1(CandidametapsilosisstrainCBS2916),相似序列EF193072󰀁1、EF190228󰀁1也有助于将3号菌株鉴定为Candidametapsilosis。

3󰀁讨论

采用分子生物学手段检测真菌,重要的前提就是能否从

图3󰀁三株真菌菌株rDNA-ITS序列的N-J系统发育树*A,*B,*C:BlastQueryIDofrDNA-ITSseq.ofNo.1,2,3fungusstrain,with536,556and502bpofsequencelengthrespectively表3󰀁1号真菌菌株rDNA-ITS序列(LCL6347)的有意义的比对序列

Max

Accession

Description

score

EF060424󰀁1Xylarialessp󰀁LM40905AB073533󰀁1

Xylariasp󰀁KU416

527

scorecoverage905527

97%97%

value0

ident97%

96󰀁2%81󰀁9%

0󰀁0380󰀁181

Total

Query

E

Max

*

Homology

*

Distance

待检样品中获取足量、稳定、质佳的真菌DNA模板。对于酵母菌,破坏相对容易且生长较快,使用次日的增菌液或直接使用菌落可用于核酸提取;对于丝状真菌,由于真菌孢子较难破碎,因而可选用破坏相对容易的菌丝体用于核酸提取,据文献报道在液体培养基中培养2~3d的菌丝体DNA产量较高[7];对于追求时间效率的快速检测中直接使用真菌菌落时,在使用裂解剂前应先在冰浴中对真菌组织充分地进行研磨和破坏(有条件的可使用液氮研磨或超声波破碎),加入裂解剂后给予充分的裂解时间(65󰀁30~60min)并不时振荡次数,以此法结合使用商品提取试剂盒可在短时间内(2~3h)获得理想的真菌DNA提取效果(见图2)。而传统常用的手工提取方法,如液氮冷冻研磨法[8]、氯化苄溶解法[9],虽经实践证明有效、可靠,但费时费力,难以在快速检测中推广使用。

PCR结束后应对扩增产物进行电泳以检查目的序列(rD󰀁NA-ITS)的扩增效果,真菌的全长ITS序列在600bp位置附近出现单一的电泳条带则表明扩增出目的条带(见图2),若无则核酸提取或扩增无效,若出现多条带表明有菌株不纯。

在进行比对分析时,核酸序列数据库中较多的相似序列会给比对分析工作带来两方面的影响,一是能提供更大的参考意义和更丰富信息用于系统学研究,另一方面过多的相似序列也会给鉴定工作带来一定的困难[13,14],而且随着GEN󰀁BANK的不断丰富,相似序列还会更多,此时:󰀁最好再使用其它序列比对分析工具也许会有益于鉴定工作,比如与2号真

2e-14685%

󰀁󰀁*为DNAMAN软件分析结果,其它为Blast分析结果,下同

表4󰀁2号真菌菌株rDNA-ITS序列(LCL28653)的有意义的比对序列

Max

Accession

Description

score

EU434727󰀁1

Penicilliumoxalicum

DQ401541󰀁1

Penicilliumoxalicumstrain083135

DQ401553󰀁1

Penicilliumterrestrestrain094303

DQ267827󰀁1

PenicilliumexpansumstrainF3

EF550979󰀁1

PenicilliumjanthinellumMTCC65

966

966

97%

0

98%

96󰀁0%

0󰀁040

979

979

96%

0

99%

97󰀁1%

0󰀁029

941

941

91%

0

99%

99󰀁8%

0󰀁002

941

941

91%

0

99%

99󰀁8%

0󰀁002

990

scorecoverage1123

97%

value0

ident99%

99󰀁1%

0󰀁009

Total

Query

E

Max

Homology

Distance

菌菌株rDNA-ITS序列相比较Maxident(最大鉴定百分比)达

到99%以上的序列有36个之多,利用BLAST在线比对工具所绘制的距离树(Distancetree)无法将2号真菌菌株鉴定到青霉的某个种(图4),而文中使用DNAMAN所绘制的系统树(Phy󰀁logeneticTree)能明显地发现与待检序列的距离与同源性最近的序列EU434727、DQ401541(均为Penicilliumoxalicum草酸青

中国卫生检验杂志2008年10月第18卷第10期󰀁ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,Oct2008;Vol18󰀁No101961

霉)(图3);󰀁结合形态学、生化(如酵母菌)等表型方法进行鉴定,不能过分依赖ITS序列分析而把它作为传统真菌形态学方法的替代方法。如2号真菌菌株ITS序列分析较难鉴定时,可观察菌落生长情况与镜下结构特征,该菌株的形态结构特征均支持草酸青霉的定性鉴定。

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(收稿日期:2008-04-14)JongejanF󰀁Onmoleculartaxonomy:

whatisinaname?[J]󰀁ExpApplAcaro,l2004,32(4):301-

图4󰀁Blast绘制的2号真菌菌株rDNA-ITS

序列的F-M-E距离树(截图)

󰀁󰀁从上述结果可看出,目前rDNA-ITS序列分析并不是能

对所有真菌的属种或组群进行鉴别,究其原因:其一,ITS区序列尽管是可变的,但对于某些物种其可变的程度相对不高,并不足以用来分析其属种或组群间的差异[10,11];其二,ITS序列分析结果还受到比对使用的基因库完善程度的影响。因此,在基因库中存在的、与待检真菌亲缘关系相近的已知真菌序列缺乏时(如文中的1号菌株)或rDNA-ITS序列上表现为极小的差异性时,ITS序列分析的应用能力就受到一定的,此时,建议将ITS序列分析结果与传统的真菌形态学鉴定结果(真菌培养特征、镜检特征等)相结合才能正确地对真菌进行鉴定,以防止误检、错检。尽管目前rDNA-ITS序列分析的应用存在一定的,但传统的真菌形态学鉴定方法受主观经验与实验条件的影响而使鉴定工作较困难,除非研究机构和专业人士,在基层单位很少具备全面的真菌形态学鉴定能力,而rDNA-ITS序列分析用于真菌鉴定相对更客观、简便、快速,因此以ITS序列分析为代表的分子生物学方法为真菌鉴定(尤其对基层单位真菌鉴定能力的建立)带来了希望,随着PCR-RFLP,RAPD,AFLP技术的成熟与原子探针、流动式单分子荧光检测等新技术新方法在ITS序列分析上的运用[12]以及生物信息学的不断完善,相信rDNA-ITS序列分析的应用将会有更大的发展空间。