・专论综述・固 ２：０嚣ｌ０ 年第９期总第２７０期第３１卷 弓形虫单克隆抗体的制备 及胶体金免疫层析试纸条研制 马 亮 ，任鹏飞 ，马艳玲 ，陈云翔 ，张艳凤 （１．吉林市动物检疫站，吉林吉林市市１３２０１３；２，长春万达兽药公司吉林市分公司，吉林吉林 １３２００１；３．吉林市丰满区红旗街道畜牧兽医站，吉林吉林市 １３２００１） 【摘 要】弓形虫病（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）是由刚地弓形虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ，ＴＯＸ）引起的一种重要人兽共患寄生 虫病，该虫是一种可寄生于有核细胞的原虫。当前对弓形虫病的诊断和治疗虽已有一些方法，但均不够理 想。本文就该病的免疫学诊断方法的研究进展加以概述，以研究ＳＡＧ２为检测抗原，以制备弓形虫ＳＡＧ２蛋 白的单克隆抗体和免疫胶体金试纸条为核心，建立一种快速、特异、便捷的检测方法，为我国弓形虫病的诊 断与防治、弓形虫与宿主关系、以及弓形虫的分子生物学等研究奠定良好基础。 【关键词】弓形虫；单克隆抗体；胶体金；试纸条 【中图分类号１Ｓ８５２．７２ ９ 【文献标识码ＩＡ 【文章编号］１６７２—２０７８（２０１０）０９—００１４—０３ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ Ｏｆ Ｔ０Ｘ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｇｏｌｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）Ｔｅｓｔ Ｐａｐｅｒ ＭＡＬｉａｎｇ。，ＲＥＮＰｅｎｇ－ｆｅｉ ，ＭＡＹａｎ—ｌｉｎｇ ，ＣＨＥＮＹｕｎ—ｘｉａｎｇ ，ＺＨＡＮＧＹａｎ—ｆｅｎｇ （１．Ａｎｉｍａｌ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｊｌｉｎ．Ｊｉｌｉｎ Ｃｉｔｙ，Ｊｉｌｉｎ Ｐｒｏｖ．１３２０１３；２．Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ Ｗａｎｄａ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｄｒｕｇ ｃｏｍｐａｎｙ Ｊｉｌｉｎ ｂｒａｎ— ｃｈ，Ｊｉｌｉｎ Ｃｉｔｙ，Ｊｉｌｉｎ Ｐｒｏｖ．１３２００１；３．Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｈｏｎｇｑｉ Ｓｔｒｅｅｔ Ｆｅｎｇｍａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ．Ｊｉｌｉｎ Ｃｉｔｙ． Ｊｉｌｉｎ Ｐｒｏｖ．１ ３２００１） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｚｏｏｎｏｓｅｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ，ＴＯＸ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ｐｒｏ— ｔｏｚｏｏｎ ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｏｎ ｋａｒｙｏｐｌａｓｔ．Ｔｈｏｕｇｈ ｔｈｅｒｅ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｓｏｍｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆＤｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆＴｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｍｅｎｔ，ｔｈｅｓｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｓ ｎｏｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ．Ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ， ｍａｋｉｎｇ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｏｎ ＳＡＧ２ ａｓ ｄｅｆｉｎｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ，ｆｏｒｃｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＯＸ－Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｇｏｌｄ ｉｍｍｕ－ ｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）ｔｅｓｔ ｐａｐｅｒ，ｗｉｈ ｔｈｅ ｔｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ ｅｓａｂｌｔｉｓｈｉｎｇ ａ ｒａｐｉｄ，ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｎｄ ａｓｉｍｐｌｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｒｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆＴｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ，ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｎｄ ａｉｔｓ ｈｏｓｔ ｎｄ ａＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｎ ＴＯＸ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ＴＯＸ；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｎｔａｉｂｏｄｉｅｓ；ｇｏｌｄ ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｓｓａｙ；ｓｔｒｉｐ 弓形虫病属真球虫目，弓形虫科。１９０８年法 传染源，中间宿主包括哺乳动物、鸟类、鱼类和爬 国学者突尼斯巴斯特研究所所长Ｎｉｃｏｌｌｅ及同事 行类等，现已知弓形虫存在于全球五大洲的至少 Ｍａｎｃｅａｕｘ在北突尼斯的一种啮齿动物刚地梳趾鼠 ２００多种动物体内。弓形虫的感染率极高，人感染 的肝脾单核细胞中发现。我国中医上称作三尸 了这种寄生虫，便患了弓形虫病，所以人群受其感 虫，是细胞内寄生虫。目前，世界性分布，广泛存 染也相当普遍。据报道全世界至少有１／３的人感 在于温血动物中，猫科动物为其终宿主和重要的 染弓形虫，许多国家的感染率达到２５％～５Ｏ％， 成年人多为隐性感染，常可使患者出现急性弓形 虫脑炎而死亡。家畜感染率为ｌ０％～５０％，而在 羊的弓形虫感染率为６０％之多，羊受感染后的表 收稿日期：２０１０年８月１０日 现特征是流产、死胎和产出弱畜，因此，给养殖业 ・ ４・ Ｌ＝ 点－ 七己 三：＇｜—— ２０１（，年第９鞭趋第２７０ 尊３ｌ卷 囤・毫论综述・ 带来严重的经济损失。随着人们生活水平的提 主关系、以及弓形虫的分子生物学等研究奠定良 高，动物已成为人类感染弓形虫的重要传染源，有 好基础。 关弓形虫病的防治已成为国内外学者关注的焦 ２国内外研究现状及分析 点，也是迫在眉睫的问题。 １９２２年捷克眼科医师Ｊａｎｋｕ报告了１例弓形 １ 免疫胶体金技术用于弓形虫诊断的意义 虫病，这是人类弓形虫病例的首次报告，弓形虫 为了寻找敏感、特异、快速的弓形虫病诊断 所致后天感染虽然在免疫力正常的宿主只引起 方法，国内外学者在弓形虫病诊断方面进行了大 轻微疾病，但是由于各种原因宿主免疫力下降时， 量研究。目前，弓形虫病调查、诊断的方法有病 隐性感染再燃，诱发严重的弓形虫脑炎。这是艾 原学方法、免疫学方法、分子生物学方法，其中 滋病（ＡＩＤＳ）患者重要死因之一，随着分子生物学 弓形虫病病原学诊断常用的有涂片检查法、动 的进展，许多学者对弓形虫进行了这方面的工作， 物接种法和卵囊检查法，通过从病料中直接检 一些研究成果已经或正在对弓形虫病的防控产 查到速殖子或卵囊为确诊标准，检测较为困难， 生积极影响，但是在弓形虫病的诊断方面主要存 检出率低。免疫学诊断方法主要有染色试验 在以下几方面的问题：用于诊断的抗原或抗体纯 （ＤＴ）、凝集试验（ＡＴ）、补体结合试验（ＣＦ）、间接血 度不够高；大多数诊断技术还不成熟，只停留在 凝试验（１ＨＡ）、酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、免疫 实验室研究阶段；用于现场快速检测的商品化弓 胶体金技术等。目前对动物弓形虫病的检测和 形虫病诊断试剂盒寥寥无几。今后应为检测提 诊断主要是采用弓形虫间接血凝试验（ＩＨＡ），对人 供可靠的诊断抗原或抗体，加快解决试剂的标准 弓形虫病的检测和诊断主要采用弓形虫ＥＬＩＳＡ 化问题，建立综合的检测系统来弥补单一检测系 法，而多数诊断方法都存在抗体检出较晚，过程 统的不足。 。 繁琐，操作复杂，灵敏度低，质量参差不齐，检测 国内外普遍采用免疫学方法检测血清中的 费用高等缺点，不利于临床大范围使用。随着 弓形虫ＩｇＧ和ＩｇＭ，所用抗原多是从感染动物中 现代分子生物学的不断发展，基因技术越来越 收集或经组织、细胞培养的弓形虫速殖子抗原。 多的被研究者用于弓形虫病的诊断，ＰＣＲ技术已 但这种制备速殖子抗原的方法昂贵费时，纯度低， 成为弓形虫病实验室诊断的重要手段。此技术 试剂盒批问差异大，不易标准化。而在原核表达 需要专业人员操作，其特点是灵敏、特异并可在 系统中表达特异的目的蛋白，因蛋白产量高、操 早期做出诊断，但操作方法繁琐，且费用较高， 作简单、费用低廉而被许多研究者选用。 不易推广，目前还多停留在实验室研究应用上， 免疫层析技术是近十年来迅速发展的一种 用于探讨简便实用的弓形虫病检验新方法，提高 将胶体金标记技术、免疫检测技术、层析分析技 弓形虫病检疫的时效性。 术、单克隆抗体技术和新材料技术等多种方法有 免疫胶体金检测技术是以胶体金为标记物， 机结合在一起的一种新型体外诊断简单技术。目 利用特异性抗原抗体反应，通过带颜色的胶体金 前，胶体金试剂条对目的物质的检测多是以双抗 颗粒来放大免疫反应系统，使反应结果在固相载 夹心法、竞争抗体法和竞争抗原法制备而成。免 体上直接显示出来，用于检测待测样品中的抗原 疫层析胶体金试剂条所用抗体以单抗最好，为防 或抗体，具有分子水平的免疫胶体金技术问世以 止出现非特异反应导致结果误判，应尽量避免使 来发展十分迅速，被作为诊断试剂广泛应用到临 用多抗，除非对多抗已将非特异反应彻底除掉。 床。目前，国内外研究学者对人的免疫胶体金检 它具有简单、快速、结果明确、操作简单和无需特 测技术比较多，而用于动物方面的比较少，还没 殊设备等优点，并有“浓缩的ＥＬＩＳＡ”之称，已成为 有进行商品化推广，本研究是建立诊断弓形虫病 临床及检疫诊断领域发展的一个新方向。 新方法的终极目标，为建立一种科学、快速、准确 ３研究内容 的检测和诊断方法，旨在研制一种用于检测弓形 虫抗体的免疫胶体金快速试纸条以解决上述难 ３．１ 弓形虫ＳＡＧ２蛋白基因的克隆与原核表达 题，为我国弓形虫病的诊断与防治、弓形虫与宿 构建弓形虫ＳＡＧ２基因的表达载体。经ＰＣＲ、 电话 ０４３１ ８６８ｔ ４７００／８６８ｌ４２８８／８６８１４ｊ ８８ Ｅ ｗｍａｉｌ：ｌｌｘｍｓｙ￣７ ｔ ６ ３．ｃ０ｍ ・１５・ ・蓉论综述・囤 １暑 ｔ驾 ２０ｌ０年第９ 憩第２７（）期第３１卷 酶切鉴定表明，成功的构建了开放阅读框完整的 胶体金颗粒，通常由玻璃纤维将免疫胶体金颗粒 弓形虫病毒基因的原核表达质粒。用ＩＰＴＧ诱导 吸附在该区。反应区则喷涂或点加两条反应线， 表达后，将全菌裂解，用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ 条为检测线，一条为质控线。检测线用以检测 检测重组菌中外源蛋白的表达情况和免疫反应 此处的抗原物质与免疫胶体金颗粒的包被抗原 一性。将重组菌裂解，包涵体变性，再通过透析将 抗体反应性。质控线则用以检测免疫胶体金颗 蛋白复性，将透析复性后的溶液经ＧＳＴ＿Ｂｉｎｄ树脂 粒上的包被蛋白质的活性及程度。反应区的材 纯化，最后用蛋白酶切除ＧＳＴ标签。 料主要是纤维素膜吸附区由较厚的滤纸或 ３．２ 弓形虫ＳＡＧ２蛋白单克隆抗体的制备 据试验要求选择两株单克隆抗体通过饱和 硫酸铵沉淀．透析除盐法进行纯化，得到足够纯 度和高活性的ＩｇＧ蛋白，用于胶体金免疫层析快 类似的吸水材料制成，将由加样区经反应区层析 上来的剩余免疫胶体金颗粒等吸附于其中，该区 提供层析的动力。免疫胶体金颗粒由加样区释 放后，经反应区，部分继续到吸附该区，完成层 析。并通过胶体金试纸条检测的敏感性试验、特 异性试验、重复性试验、稳定性试验来测定试纸 条的性能。 速诊断方法的建立。 利用纯化的蛋白为抗原免疫小鼠（免疫时间 分别为ｌｄ，１５ｄ，２９ｄ）。最后一次免疫３ ｄ后，按常 细胞融合。融合后的细胞用ＨＡＴ培养基悬浮，３～ 规方法进行，取脾细胞与处于对数生长期的ＳＰ２／０ ４结论 本文以大量的实验研究证据，采用的实验方 ５ｄ换加新鲜ＨＡＴ，８～１０ｄ后改用ＨＴ培养基，经 法大部分是成熟的实验技术，进行了弓形虫ＳＡＧ２ 常观察，适时换液和检测。经间接ＥＬＩＳＡ筛选能 的原核表达及单克隆抗体的制备，并通过免疫胶 特异性分泌单抗的杂交瘤细胞株。分别从免疫 体金技术，以胶体金标弓形虫ＳＡＧ２抗原建立了 小鼠、提供饲养细胞的小鼠采血，作为筛选单抗 免疫层析试纸条，用于检测样本中的弓形虫抗体， 时对照用的阳性、阴性血清，然后进行单克隆抗 从而建立一种简易、快速、特异性强的检测方法， 体的大量制备。同法再制备阴性腹水，将收集的 专用于弓形虫病的血清学诊断，达到推动重大人 小鼠腹水或细胞培养上清用ＥＬＩＳＡ法鉴定单抗 畜共患寄生虫病高通量快速检测试剂的实用性， 的免疫球蛋白类型及亚型。 其结果最大程度的防控疫情发生，应对突发公共 ３．３ 弓形虫ＳＡＧ２蛋白的胶体金免疫层析检测试 卫生事件，快速提高对动物性食品安全检验系数。相信在不久的将来，弓形虫的胶体金免疫层析试 纸的研制 纸必能广泛应用于生产实践中，为动物检疫检验 在试纸条的塑料片上依次粘贴如下组分：加 样区、反应区和吸附区三部分。加样区含有免疫 及动物疫病检测提供更灵敏高效、操作程序简便、 方便快捷的检疫检测手段。目 ・行业动态・ 部分猪肉，目的在于稳定生猪生产市场，防止出 现生猪养殖大面积亏损而过多地损害养殖户的 国家开展冻肉收储稳定生猪市场 建议养殖户继续调整养殖结构 利益。这次冻肉收储价格以“不打压市场实际成 交价格”为原则，收储价格不低于各收储库点地 区猪肉平均批发价格。同时，我们也应该看到， 当前我国生猪市场供大于求的状况仍将持续一 受生猪市场供大于求的影响，５月份以来，我 段时间。建议生猪养殖户继续调整养殖结构，适 国猪粮比价已连续６周低于６：１的盈亏平衡点， 当减少能繁母猪的饲养和仔猪的存栏。通过市 处于《防止生猪价格过度下跌预案（暂行）》 场调节和收储，尽快恢复生猪市场的供求平 规定的蓝色区域。经批准，国家有关部门 衡。圈 已在全国开展了冻肉收储工作。入市收储 （新闻来源：东北饲料信息网） ・１６・ 电疆，０４３ｊ一８６８ ４７００ ８６８｛４２８８／８６８１４１ ８８ Ｅ—ｍａｉｌ：ＪＩｘｍｓ），＠ｉ ６３ １３ｏ／７ｌ
