・实验研究・ ２０１２年ｌ０月第９卷第２８期 １３一细辛醚通过ＰＫＡ／ＣＲＥＢ信号通路 对快速老化痴呆小鼠脑组织凋亡机制的影响 王睿 费洪新ｚ 李晓明 王伟： 刘韩 牛英才 刘向民。 周涛２ １．齐齐哈尔医学院医药科学研究所，黑龙江齐齐哈尔１６１００６；２．齐齐哈尔医学院基础医学院。黑龙江齐齐哈尔 １６１００６ 【摘要】目的研究Ｂ一细辛醚对快速老化痴呆小鼠大脑组织蛋白激酶Ａ（ＰＫＡ）、ｃＡＭＰ反应元件结合蛋白（ＣＲＥＢ）的影 响。方法选取健康昆明小鼠ｌ０只作为对照组，３０只快速老化小鼠被随机分为模型组（１０只）、实验组（１０只）、治 疗组（１０只）。对照组采用生理盐水灌胃，２ ｍＬ／次；实验组采用Ｂ一细辛醚混浊液灌胃，２ ｍＬ／次；治疗组采用脑复康水 溶液５ ｍｇ／ｍＬ灌胃，２ ｍＬ／次；模型组采用生理盐水灌胃，２ ｍＬ／次。所有小鼠均每天灌胃１次，持续３周。３周后进行 小鼠行为学测试，检测脑组织ＰＫＡ、ＣＲＥＢ酶改变及光镜和电镜下神经元细胞形态变化。结果实验组和治疗组与 模型组相比，潜伏期明显缩短、在原平台停留时间延长，ＰＫＡ、ＣＲＥＢ活性与模型组比较均明显增高，差异有统计学 意义（Ｐ＜０．０５）。光镜下观察实验组海马神经元损伤较轻，大部分细胞核清楚完整，电镜下核周隙清晰，细胞器清晰， 神经纤维较丰富。结论Ｂ一细辛醚能提高快速老化痴呆小鼠知识记忆能力，影响ＰＫＡ／ＣＲＥＢ传导路径和突触结构， 减少快速老化痴呆小鼠大脑组织神经元损伤，对快速老化痴呆小鼠有明显治疗作用。 『关键词】Ｂ一细辛醚；ｃＡＭＰ反应元件结合蛋白；神经元 『中图分类号】Ｒ３３２ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１６７３—７２１０（２０１２）１Ｏ（ａ）一００３０—０３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ－ａｓａｒｏｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ＰＫＡ／ＣＲＥＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ａｇｉｎｇ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｍｉｃｅ ＷＡＮＧ Ｒｕｉ｜ ＦＥＩ Ｈｏｎ￣ｉｎ２ ＬＩＸｉａｏｒｎｉｎ￣ ＷＡＮＧ Ｗｅｉ｜ＬＩＵ Ｈａｒｔｌ ＮＩＵ Ｙｉｎｇｅａｉｌ ＬＩＵＸｉａｎｇｍｉｎ２ ＺＨＯＵ Ｔａｏ２ １．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｑｉｑｉｈａｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｑｉｑｉｈａｒ １６１００６，Ｃｈｉｎａ；２．Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｑｉｑｉｈａｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｑｉｑｉｈａｒ １６１００６，Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ３－ａｓａｒｏｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ＰＫＡ／ＣＲＥＢ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ａｇｉｎｇ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｍｉｃｅ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １０ ｈｅａｌｔｈｙ Ｋｕｎｍｉｎｇ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，３０ ｒａｐｉｄ ａｇｉｎｇ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ（１０），ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ（１０），ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ（１０）．Ｍｉｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｌａｖａｇｅｄ ｗｉｔｈ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｌｉｎｅ，２ ｍＩ＿／ｔｉｍｅ； ｍｉｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｌａｖａｇｅｄ ｗｉｔｈ Ｂ－ａｓａｒｏｎｅ，２ ｍＬ／ｔｉｍｅ；ｍｉｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｌａｖａｇｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｉｒａｃｅｔａｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５ ｍｇ／ｍＬ），２ ｍＬ／ｔｉｍｅ；ｍｉｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｌａｖａｇｅｄ ｗｉｔｈ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｌｉｎｅ，２ ｍＬ／ｔｉｍｅ．Ａｎｄ ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ ｗｉｔｈ ３ ｗｅｅｋｓ．Ａｆｔｅｒ ３ ｗｅｅｋｓ ｆ１ ｔｉｍｅ／ｄ），ｔｈｅ ｍｉｃｅ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ ｅｖｅｒｙ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ，ＰＫＡ，ＣＲＥＢ ｅｎｚｙｍｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ ｓｈｏｗｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｓｈｏｒｔｅｒ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ，ｌｏｎｇｅｒ ｏｒ ｉｇｉｎａｌ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ，ＰＫＡ，ＣＲＥＢ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｄｉｆ－ ｆｅｒｅｎｃｅ ｗａｓ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ（Ｐ＜０．０５）．Ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ，ｕｎｄｅｒ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｔｈｅ ｄａｍａｇｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ ｗａｓ ｌｉｇｈｅｒ，ｍｏｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅｕｓ ｗｅｒｅ ｃｌｅａｒｌｙ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ，ｕｎｄｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｐｅｒｉｎｕｃｌｅａｒ ｓｐａｃｅ ｗａｓ ｃｌｅａｒｌｙ ｖｉｓｉｂｌｅ，ｍｏｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ ｗｅｒｅ ｖｉｓｉｂｌｅ，ｎｅｒｖｅ ｆｉｂｅｒｓ ｗｅｒｅ ａｂｕｎｄａｎｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｂ—ａｓａｒｏｎｅ ｃａｎ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ａｇ— ｉｎｇ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｍｉｃｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ａｂｉｌｉｔｙ，ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ＰＫＡ／ＣＲＥＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ａｆｆｅｃｔ ｓｙｎａｐｔｉｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ａｌｓｏ ｃａｎ ｒｅｄｕｃｅ ｎｅｕｒｏｎ ｃｅｌｌｓ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ．Ｉｔ ｈａｓ ｓｉｇｎｉｉｃａｎｔｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｇｉｎｇ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｍｉｃｅ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｂ—ａｓａｒｏｎｅ；ＣＲＥＢ；Ｎｅｕｒｏｎ ‘ 阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）是一种神经系统 退行性疾病，老年人多发，丧失生活能力，主要是在大脑海马 区域出现淀粉样物质，即淀粉样１３蛋白（ａｍｙｌｏｉｄ ６ ｐｒｏｔｅｉｎ， Ａ１３）．Ａ１３可以使组织产生大量自由基，干扰钙离子代谢，影 响炎症反应，从而引起脑神经元发生改变，神经元功能也会 发生改变，引起ＡＤ发生ｌ１－２１，症状上表现学习和记忆障碍是 【基金项目】黑龙江省自然科学基金面上项目（Ｄ２００９５５）。 ［作者简介】王睿（１９７５．２一），副研究员，硕士，主要从事老年痴呆疾病研究。 【通讯作者】费洪新（１９７９．７一），讲师，硕士，从事抗肿瘤疾病研究。 ３０中国医药导报ＣＨＩＮＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＨＥＲＡＬＤ 最早出现的 目前国内外尚无特效药物进行治疗。石菖蒲挥 发油是对机体中枢神经系统有保护作用有效成分，其中１３一 细辛醚是石菖蒲挥发油的主要成分，Ｂ一细辛醚对机体自由基 的产生有重要作用，是治疗神经系统的一种药物。Ｂ一细辛醚 可促进氧自由基代谢，影响大脑学习和记忆能力。本文笔者 通过将饲养动物分组后给予Ｂ一细辛醚探讨ＡＤ发病原因， 且观察对老年痴呆小鼠ＰＫＡ／ＣＲＥＢ信号通路的影响作用和 快速老化小鼠学习记忆能力影响，分析Ｂ一细辛醚药物作用 机制 ２０１２年１０月第９卷第２８期 ・实验研究・ １材料与方法 １．１材料 ＬＳＤ—ｔ检验。Ｐ＜０．０５表示差异有统计学意义。 ２结果 １．１．１试剂与仪器１３一细辛醚购于武汉博士德生物工程有限 ２．１ Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫定位航行实验和空间探索实验结果 Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验中，模型组与对照组比较，平台潜伏 公司，制成０．１ ｍｄｍＬ混浊液，每天小鼠灌胃量是２ ｍＬ； ＰＫＡ、ＣＲＥＢ一抗、ＳＰ试剂盒购于武汉博士德生物工程有限 公司；ＤｖｄａｔｅｃｈＭＲ４０００型酶标仪购自ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司， ＭＰＩＡＳ一５００病理图像分析系统由中国医学科学院药物研究 所提供，：其他均为国产分析醇试剂。 １．１２动物分组选取健康昆明小鼠１０只和快速老化小鼠３０只。 均为ｌ０个月大小、雄性、体重２Ｏ～２５ ｇ．由哈尔滨医科大学实 期缩短，原平台停留时间缩短，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）， 说明模型稳定，可以用于实验研究。实验组、治疗组与模型组 比较，潜伏期明显缩短，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），实验 组、治疗组与模型组比较，原平台停留时间延长，差异有统计 学意义（Ｐ＜０．０５），提示Ｂ一细辛醚能改善快速老化小鼠的学 习记忆能力、空间探索能力，增强小鼠的记忆力（表１）。 验动物中心提供。健康昆明小鼠ｌ０只作为对照组，３０只快 速老化小鼠物随机分为模型组（１０只）、实验组（１０只）、治疗 组（１０只）。对照组采用生理盐水灌胃，２ ｍＬ／次；实验组采用 Ｂ一细辛醚混浊液灌胃，２ ｍＬ／次；治疗组采用脑复康水溶液 ５ ｍｄｍＬ灌胃，２ ｍＬ／次；模型组采用生理盐水灌胃，２ ｍＬ／次。 所有小鼠均每天灌胃１次，持续３周。 １．２方法 １．２．１ Ｈｏ ｒｒ１ ５水迷宫定位航行实验实验小鼠灌胃３周后 进行行为学测试，连续５ ｄ，实验前１ ｄ适应性训练，平台放 在第一象限，其他３个象限将其放人水中，每天各测１次，在 ２ ｍｉｎ内尚未找到平台，则将其放平台１０ ｓ；若１２０ Ｓ之内找 到平台，则其在平台１０ ｓ，实验进行５ ｄ。利用上台潜伏期代 表实验小鼠的空间学习能力，采用Ｍｏｒｒｉｓｍｉｃｒｏｓｏｆｔ基础类应 用程序纪录逃避潜伏期和游泳距离，两次潜伏期算术均值作 为这一天成绩进行统计学分析，处理结果。 １．２．２ Ｈ０Ｉ ｒ１ ５水迷宫空间探索实验实验小鼠进行空间探索 试验是任选一个入水点将小鼠放入水池中进行试验．记录各 组实验小・鼠在规定的时间内游泳轨迹．考察各组实验小鼠对 原平台记忆，选择任选一相同入水点将各组实验小鼠放入水 池中，记录各组实验小鼠在实验进行２ ｍｉｎ之内游泳路线，同 时记录停留时间，并对其进行实验统计分析，处理结果。 ｌ－２．３ ＰＫＡ、ＣＲＥＢ的测定实验小鼠乙醚麻醉，断头取出含有 海马组织的脑组织，固定２４ ｈ，ＰＢＳ洗涤，４℃保存１２ ｈ， 梯度乙醇脱水，透明，浸蜡，石蜡包埋，切片组织厚度６ ｍ， 采用海马组织分别测定ＰＫＡ、ＣＲＥＢ．３７℃温箱孵育１０ ｍｉｎ， ＰＢＳ洗涤，抗原修复１０ｍｉｎ，正常羊血清３７℃温箱孵育１０ｍｉｎ。 一抗（ＰＫＡ、ＣＲＥＢ为１ １００）３７℃温箱孵育１ ｈ．ＰＢＳ洗涤，二 抗ＩｇＧ—ＨＲＰ加人后，３７℃温箱孵育３０ ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤．ＤＡＢ 显色液显色，ＰＢＳ洗涤，苏木精染色，脱水，透明，封片。测定 部位在海马区，使用病理图像分析系统测定吸光度值．计算 阳性细胞数。 １．２．４小鼠海马神经元形态学光镜观察实验小鼠乙醚麻醉， 断头处死，取出脑组织，沿冠状切面切下前囟尾侧２．２～４．３ ｍｍ 的海马组织，固定，ＰＢＳ洗涤，４℃保存１２ ｈ．梯度乙 醇脱水，透明，浸蜡，石蜡包埋，连续切片，切片厚７ ｍ，ＨＥ 染色，光镜下观察拍照。 １．２．５小鼠海马神经元形态学电镜观察实验小鼠乙醚麻醉。 打胸后心脏灌注固定液，快速取脑，分离海马，２．５％戊二醛预 固定２ ｈ、四氧化锇固定，梯度乙醇脱水，透明，浸蜡。石蜡包 埋，连续切片，醋酸铀及枸橼酸铅双染色，电镜下观察拍照。 １．３统计学方法 用ＳＰＳＳ １２．０统计软件处理分析，计量资料数据以均数± 标准差（ ）表示，多组问比较采用方差分析，两两比较采用 表１ 各组小鼠Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验结果比较（ ±ｓ．Ｓ） 注：与模型组比较，ＯＦ＜Ｏ．０５，印＜０．０５， ＜０．０５，ｂｐ＜０．０５；治疗组比 较，叩＜０．０５，叩＜Ｏ．０５；与对照组比较，叩＜Ｏ．０５，叩＜Ｏ．０５ ２．２小鼠海马神经元ＰＫＡ、ＣＲＥＢ测定 小鼠海马神经元模型组与对照组比较，ＰＫＡ、ＣＲＥＢ吸光 度（ ）数值明显降低，蛋白数量较少，差异有统计学意义（Ｐ＜ ０．０５），表明模型组ＰＫＡ表达减少，ＣＲＥＢ信号表达减少。动 物给药后实验组与模型组比较，ＰＫＡ表达增多，ＣＲＥＢ信号 表达增多，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），说明Ｂ一细辛醚对 快速老化小鼠治疗有效（表２）。 表２ 各组小鼠ＰＫＡ、ＣＲＥＢ蛋白表达分析（ ±ｓ】 注：与模型组比较，叩＜Ｏ．０５，‘印＜Ｏ．０５；与治疗组比较，（ ＜Ｏ．０５，‘ ＜０．０５；与对照组比较， ＜０．０５， ＜Ｏ．０５ ２．３光学显微镜观察小鼠海马神经元 倒置相差显微镜下观察，对照组小鼠海马神经元脑组织 锥体细胞清晰可见，细胞形状锥体形，细胞核清晰，细胞器丰 富，可见明显的尼氏体，显示蛋白石合成旺盛（图１ａ）；模型组 小鼠海马神经元脑组织锥体细胞形态不规则，呈现多边形， 细胞核较小，核仁不清晰，细胞整体损伤严重，细胞质中细胞 器较少（图ｌｂ）；治疗组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞形 状锥体形或、长梭形，细胞器部分可以看到（图１ｃ）；实验组小 鼠海马神经元脑组织锥体细胞少量损伤。细胞边界较清晰． 细胞形态较完整（图ｌｄ）。 ２．４电子显微镜观察小鼠海马神经元 对照组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞形状是锥体形。 细胞器丰富，可见大量的粗面内质网，神经原纤维丰富、排列 规则有序（图２ａ）。模型组则小鼠海马神经元脑组织锥体细 胞损伤严重，细胞体积缩小，细胞核周边结构混乱，脂滴较 多，细胞器较少（图２ｂ）。治疗组小鼠海马神经元脑组织锥体 细胞结构清晰，细胞器清晰可见，线粒体丰富。异物颗粒较少 ＣＨＩＮＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＨＥＲＡＬＤ中国医药导报３１
