法测定巴天酸模中7个蒽醌类成分含量-王鹏

JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM

辽宁中医药大学学报

Vol. 18 No. 1 Jan .，2016

DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2016.01.019

HPLC-MS/MS法测定巴天酸模中7个蒽醌类成分含量

2

王鹏1，，王晓明1，潘桂湘1，冯红1

（1.天津中医药大学，天津市现代中药国家重点实验室，天津 300193；2.天津国际生物医药联合研究院，天津 300457）目的：采用HPLC-MS/MS法测定巴天酸模中7个蒽醌类成分的含量。方法：采用SB-C18色谱摘 要：

柱（4.6 mm×100 mm，1.8 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）。梯度洗脱程序为：0~8.5 min，95%~95% A；8.5~8.51 min，95%~40% A；8.51~12 min，40%~40% A。流动相流速为0.4 mL/min，柱温为20 ℃，进样量为10 μL。结果：大黄酸、芦荟大黄素在2.5~50 ng/mL，大黄素、大黄素甲醚在10~250 ng/mL，大黄酚在25~1000 ng/mL，大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷在10~500 ng/mL范围内，进样量与峰面积具有良好线性关系（r2均>0.98）。同时，其平均加样回收率在90.32%~106.75%（n=6）。结论：该方法简便、准确、灵敏，可用于巴天酸模中蒽醌类成分的含量测定。

关键词：液质联用；巴天酸模；蒽醌；含量

(2016) 01- 中图分类号：R284 文献标志码：A 文章编号：1673-842X 0059- 03

Determination of Seven Anthraquinones Constituents in Polygonum Rumex Patientia L. by HPLC-MS/MS2WANG Peng1，，WANG Xiaoming1，PAN Guixiang1，FENG Hong1（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tianjin International Joint Academy of Biomedicine，Tianjin 300457，China）Abstract：Objective：To establish a HPLC-MS/MS method for determining the content of seven anthraquinones constituents in Polygonum Rumex Patientia L. Methods：A SB-C18 column（4.6 mm×100 mm，1.8 μm）was used with a mobile phase of acetonitrile（A）-0.1% acetic acid in water（B）. The gradient elution program was as follows：0~8.5 min，95%~95% A；8.5~8.51 min，95%~40% A；8.51~12 min，40%~40% A. The column temperature was set at 20 ℃. The flow rate was kept at 0.4 mL/min and the sample volume was 10 μL. Results：All calibration curves had good linearity（r2>0.98）over the concentration ranges of 2.5~50 ng/mL for rhein and aloe rhein，10~250 ng/mL for emodin and physcion，25~1000 ng/mL for chrysophanol，10~500 ng/mL for emodin-8-O-glucoside and physcion-8-O-glucoside. And the average recoveries were all ranged in 90.32%~106.75%（n=6）. Conclusion：The method is simple，accurate and sensitive for the determination of anthraquinones constituents in Polygonum Rumex Patientia L..Keywords：HPLC-MS/MS；Polygonum Rumex Patientia L.；anthraquinones；content巴天酸模（Polygonum Rumex Patientia L.）系蓼科酸模属植物，又名洋铁酸模、牛西西、土大黄等，在[ 4 ] 赖玲，杨光，杨昕.熊果酸固体分散体的制备与体外溶出度测定[ J ] .医药导报，2005，24 ( 6 )：517-518．[ 5 ] PoutonCW. Formulationof self-emulsifyingdrugdelivery system[ J ] . Adv Drug Deliv Rev，1997，25 ( 1 )：47.[ 6 ] Bogman K，Ernebrand F，Alsenz J，et al. The role of surfactants in the reversal of active transport mediated by multidrug resistance proteins[ J ] .J Pham Sci，2003，92 ( 2 )：1250-1261.[ 7 ] 孙丹丹，徐新刚，生立嵩，等.星点设计-效应面法优化熊果酸自微乳给药系统[ J ] .中国实验方剂学杂志，2013，19 ( 8 )：我国东北、华北及西北各省区均有分布。其根肥厚，显黄色，是常用的中草药，具凉血止血、清热解毒、杀46-50.[ 8 ] Panayiotis P Constantinides，Karel J Lambert，Alex K Tustian，et al.Formulation development and antitumor activity of a filter-sterilizable emulsion of paclitaxel[ J ] . Pharm Res，2000，17 ( 2 )：175-181.[ 9 ] 刘颖，张萍，冯年平，等.冬凌草甲素自微乳给药系统的体外释放动力学研究[ J ] .中国中药杂志，2008，33 ( 18 )：2049-2051.[ 10 ] 和平.齐墩果酸静脉注射乳剂的研制[ D ] .郑州：河南大学，2009.收稿日期：2015-07-15基金项目：国家自然基金项目（81173523、81303182）；国家科技支撑计划项目（2011BAI07B08）作者简介：王鹏（1988-），男，河北石家庄人，硕士，研究方向：药物分析。通讯作者：潘桂湘（1976-），男，福建泉州人，副研究员，博士，研究方向：药物分析。

59

             辽宁中医药大学学报             18卷

虫等功效[1]，现代药理研究发现巴天酸模具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化和免疫调节等作用，可用于治疗多种皮肤病、出血症和各种炎症等疾病[2-4]。巴天酸模含有蒽醌、黄酮、萘及萘醌、二苯乙烯类等成分[5]。其中蒽醌类成分（如大黄素、大黄酚等）具有抑菌消炎、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、止血等多种药理活性，为巴天酸模的主要药效物质，常以游离蒽醌和结合蒽醌形式存在[6-9]。目前，巴天酸模中蒽醌类成分的含量测定报道不多[10-15]，有的侧重游离蒽醌的测定，有的侧重结合蒽醌的测定。结合蒽醌口服给药后，存在生物转化成游离蒽醌的现象[16]，提示在进行药材质量控制时有必要对两种类型蒽醌进行同时测定。因此，本实验建立了LC-MS/MS的方法，同时测定巴天酸模中7种蒽醌类成分（大黄酸、大黄素、芦荟大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷）的含量，以期为巴天酸模的质量控制提供参考依据。1 仪器与试剂1.1 仪器Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司），API 3200三重四级杆质谱仪（美国AB SCIEX公司），3K15高速离心机（美国Sigma公司），KQ-250E超声波清洗器（中国昆山市超声仪器有限公司），BP121S万分之一天平（德国Sartorius公司），XW-80A旋涡混合器（中国上海沪西分析仪器厂），Mill-QⅡ型超纯水器（Millipore公司）。1.2 试药巴天酸模采自天津市蓟县下营镇，经天津中医药大学李天祥副教授鉴定。大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、华法林标准品（中国药品生物制品检定所，纯度>98%），大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷为自制，并经过检测纯度>98%。乙腈（色谱纯，Fisher），甲酸（色谱纯，Tedia），超纯水为Millipore超纯水净化系统制得。2 方法与结果2.1 色谱条件安捷伦1200高效液相色谱仪，Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×100 mm，1.8 μm），Agilent Zorbax SB-C18保护柱（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），流速为0.4 mL/ min；柱温为20 ℃，进样量为10 μL，分析时间为12 min。梯度洗脱程序见表1。表1 梯度洗脱程序时间（min）A（%）B（%）095 58.595 58.5140601240602.2 质谱条件API 3200™三重四级杆质谱仪，TurboIonSpray®离子源，负离子分析模式，MRM扫描方式。参数设置：气帘气（CUR）：15 psi；碰撞气（CAD）：5；离子喷雾电压（IS）：4000 V；温度（TEM）：350 ℃；气流1（GS1）：40 psi；气流2（GS2）：50 psi；加热（Ihe）：On。各化合物的MRM方法参数见表2。60

表2 各标准品的MRM方法参数成分母离子子离子驻留时间去簇电压入口电压碰撞能量碰撞室出口电压Q1Q3Dwell Time（ms）DP（V）EP（V）CE（V）CXP（V）大黄酸282.9210.9200-24-5-38-2大黄素269.1182.0200-44-5-50-1大黄酚252.9224.8200-50-4-41-2大黄素甲醚282.9240.1200-46-5-36-3芦荟大黄素268.9239.1200-41-5-40-2大黄素-8-O-葡萄糖苷431.1269.0200-50-4-42-7大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷445.1282.9200-21-7-26-3华法林307.0116.9200-40-5-50-2注：MRM交替时间：5 ms；分辨率：Q1、Q3皆为单位分辨率。2.3 溶液的制备2.3.1 对照品溶液的制备分别精密称取大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷、华法林（内标物）标准品适量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，使其成浓度均为100 μg/mL的标准品储备液，置于4 ℃冰箱中，备用。2.3.2 供试品溶液的制备取巴天酸模药材粉末（过10目筛）约0.5 g，精密称定，置于25 mL容量瓶中，再加入0.25 mL内标溶液（华法林5 μg/mL），后加甲醇定容至刻度，超声提取1 h，静置，取上清液0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液，备用。2.4 线性关系精密移取各对照品溶液适量，用流动相稀释配制成系列浓度的混合对照品溶液，并加入浓度为50 ng/mL的内标溶液，涡旋混匀，以峰面积比值为纵坐标，以各待测物浓度（X）为横坐标，权重系数1/X2，作线性回归。7个蒽醌类成分的线性关系考察见表3，结果表明大黄酸、芦荟大黄素在2.5~50 ng/mL，大黄素、大黄素甲醚在10~250 ng/mL，大黄酚在25~1000 ng/mL，大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷在10~500 ng/mL范围内线性良好。表3 线性关系考察化合物 线性范围（ng/mL）回归方程相关系数R2大黄酸2.5~50Y=0.00422X+0.00336 0.9811大黄素 10~250Y=0.00928X+0.05570.9912芦荟大黄素2.5~50Y=0.000616X-0.00008390.990黄酚 25~1000Y=0.00065X+0.00220.9872大黄素甲醚 10~250Y=0.000874X-0.001120.9872大黄素-8-O-葡萄糖苷 10~500Y=0.000408X+0.0005920.987黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷 10~500Y=0.000363X-0.001670.982.5 精密度与准确度分别取低、中、高3个浓度的样品，按照“2.4 线性关系的考察”中标准曲线的方法进行操作，记录待测物大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷与内标华法林的峰面积比值，代入标准曲线中，计算浓度。精密度为测得浓度的变异值，以RSD表示，准确度用RE表示。批内精密度为平行处理6个样品，批间精密度为连续测定3批样品。结果表明7个化合物的批内、批间精密度RSD<15%，准（Y） 18卷                                  辽宁中医药大学学报              确度均在100%±15%范围内。2.6 加样回收率的考察称取已知含量的巴天酸模药材适量，分别精密加入一定量的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷与内标华法林，平行操作6份，按照“2.3.2 供试品溶液的制备”项下方法进行处理，精密吸取处理好的样品，以（测得值-基础值）/加标值×100%计算回收率。各化合物回收率分别为大黄酸106.2%、大黄素95.33%、芦荟大黄素90.32%、大黄酚99.13%、大黄素甲醚91.48%、大黄素-8-O-葡萄糖苷94.00%、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷106.75%。2.7 最低定量限将各对照品溶液用甲醇溶液稀释至一定浓度，进样测定各化合物的最低定量限。7个化合物的最低定量限分别为，大黄酸、芦荟大黄素：0.025 ng，大黄素：0.01 ng，大黄酚、大黄素甲醚、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷：0.1 ng。2.8 样品稳定性取处理好的样品溶液，于室温下分别放置0、1、2、4、8、10 h，测定样品的稳定性，结果显示RSD<5%，表明样品溶液在室温条件下稳定。2.9 样品含量测定与重复性考察分别精密称取巴天酸模药材适量，按照供试品溶液的制备”项下的方法，平行操作6份，进行重复性考察和样品的含量测定，结果见表4。表4 巴天酸模中7个蒽醌类成分的含量（n=6）化合物含量（mg/g）大黄酸0.00017大黄素0.02320芦荟大黄素0.00432大黄酚0.07185大黄素甲醚0.04510大黄素-8-O-葡萄糖苷0.02475大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷0.002253 讨论3.1 电离方式的选择质谱条件的优化是通过将1 μg/mL的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷的标准品溶液经由蠕动泵10 μL/min连续进样，并对各质谱参数进行考察，以待测物响应值目标。由于测定的7种蒽醌易产生[M-H]-离子，所以试验中选择负离子方式进行扫描。3.2 流动相pH的选择大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖均含有羟基，呈弱酸性，对pH值较敏感。当pH值低于化合物PKa时，会以分子态存在；当pH值高于PKa时，则以解离态存在。调节流动相的酸度，使蒽醌成分以其中一种形式存在，可获得良好的峰形，故在流动相中加入适量HCOOH，以提高响应、改善峰形。试验考察了流动相中不含及含有0.05%、0.1%的HCOOH对于分析物响应及峰形的影响，发现HCOOH浓度较高响应较好，峰形也好，故确定流动相中添加的酸浓度为0.1% HCOOH。4 结论在实验建立的HPLC-MS/MS法，可同时准确地对巴天酸模中的7个蒽醌类成分进行含量测定。巴天酸模中主要蒽醌成分的含量按高低顺序排列，依次为大黄酚、大黄素甲醚、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷、大黄酸。◆参考文献[ 1 ] 张洪魁. 中国中药杂志[ M ] .北京：科学出版社，1994.[ 2 ] 伊合帕尔·木拉提，艾合买提·买买提，玛依努尔·阿不拉. 维吾尔医治疗银屑病108例临床观察[ J ] .中国民族医药杂志，2005 ( 3 )：3.[ 3 ] Chang CH，Lin CC，Yang JJ，et al. Anti-inflammatiry effects of emodin from ventilago leiocarpa[ J ] .Am J Chin Med，1996，24 ( 2 )：139-142.[ 4 ] 王莉，旺姆，桑姆. 尼泊尔酸模根中活性蛋白—凝集素特性初探[ J ] .中国野生植物资源，2004 ( 4 )：48-49.[ 5 ] 张燕，李治建，夏木西努尔·肖盖提，等. 土大黄化学成分及药理作用研究进展[ J ] .中药药理与临床，2012，28 ( 3 )：173-176.[ 6 ] El-Kader AMA，El-Mawla AMAA，Mohamed MH，et al. Phytochemical and biological studies of Emex spinosa（L.）Campd. growing in Egypt[ J ] .Bull Pharm Sci，2006，29：328-347.[ 7 ] Litvinenko YA，Muzychkina RA. Phytochemical investigation of biologically active substances in certain Kazakhstan Rumex species. 1[ J ] .Chem Nat Compd，2003，39 ( 5 )：446-449.[ 8 ] Wegiera M，Smolarz HD，Wianowska D，et al. Anthracene derivatives in some species of Rumex L. genus[ J ] .Acta Soc Bot Pol，2007，76 ( 2 )：103-108.[ 9 ] Liu SY，Sporer F，Wink M，et al. Anthraquinones in Rheum palmatum and Rumex dentatus（Polygonaceae），and phorbol esters in Jatropha curcas（Euphorbiaceae）with molluscicidal activity against the schistosome vector snails Oncomelania，Biomphalaria and Bulinus[ J ] .Trop Med Int Health，1997，2 ( 2 )：179-188.[ 10 ] Guo SY，Feng B，Zhu RN，et al. Preparative Isolation of Three Anthraquinones from Rumex japonicus by High-Speed Counter-Current Chromatography [ J ] .Molecules，2011，16 ( 2 )：1201-1210.[ 11 ] 王克英. HPLC测定土大黄中大黄素的含量[ J ] .中国中医药信息杂志，2003，10 ( 9 )：34-35.[ 12 ] 原源，陈万生，张汉明，等. HPLC法测定酸模属植物根中蒽醌类成分的含量[ J ] .第二军医大学学报，2000，21 ( 10 )：952-954.[ 13 ] 杜鹃，吴桂芳，刘雅华. RP-HPLC法测定贵阳地区不同采收期土大黄中大黄素及总游离蒽醌含量[ J ] .中草药，1998，29 ( 6 )：387-388.[ 14 ] Zhu JJ，Zhang CF，Zhang MA，et al. Separation and identification of three epimeric pairs of new C-glucosyl anthrones from Rumex dentatus by on-line high performance liquid chromatography-circular dichroism analysis[ J ] .J Chromatogr A，2010，1217 ( 33 )：5384-5388.[ 15 ] Gautam R，Srivastava A，Jachak SM. Simultaneous Determination of Naphthalene and Anthraquinone Derivatives in Rumex nepalensis Spreng. Roots by HPLC：Comparison of Different Extraction Methods and Validation[ J ] .Phytochem Analysis，2011，22 ( 2 )：153-157.[ 16 ] Shia CS，Juang SH，Tsai SY，et al. Metabolism and pharmacokinetics of anthraquinones in Rheum palmatum in rats and ex vivo antioxidant activity[ J ] .Planta medica，2009，75 ( 13 )：1386-1392.61

“2.3.2