蛋白Western_blot技术

1. transfer：先用甲醇浸PVDF膜1min（可用铅笔在一角标记，分别正反面），

沥干放入transfer buffer（应该要重新配置了，上次配置的液体使用太久），海绵、滤纸也放入transfer buffer浸湿；按以下顺序从下往上放置：黑色塑料板、海绵、滤纸、胶、PVDF膜, 滤纸、海绵、白色塑料板，可用垫片（我个人觉得玻璃棒或者移液管比较好用）刮尽胶与滤纸之间的气泡（一定要刮干净气泡，不然会导致蛋白不能在有气泡处转移），最后可用橡皮筋加固（顺序不能颠倒，橡皮筋固定可以省略）；

2. 放入仪器时，相同颜色的在同一侧（黑色对黑色，白色对红的）；设置运行

参数：200mA，3hr或100 mA过夜；

3. Blocking：PBS + 4-10%脱脂奶粉，室温，2hr或4C过夜（我们一般是从早

上8：00－9：00将摇床与膜置于4C冰柜中blocking到下午4：30左右）； 4. 倒掉封闭液（应将膜的一角用镊子夹起，倒掉奶粉，并用自来水洗涤干净盒

子，最好用PBST缓冲液润洗一次，注意膜的正反面千万不能弄错，否则蛋白会从膜上磨下来），PBS--0.05%Tween 20洗三次，各5min，每次加的洗涤液体宜超过100ml；

5. Primary Antibody（血清）与PBS--0.05%Tween 20按1∶5000—1∶20000的

比例混合浸泡膜1hr；（我们的亚历山大藻用1：5000，东海原甲藻1：2500基本上就应该可以做出不错的结果，具体的滴度可以根据你做实验的情况调节，若背景太高，调低滴度，显示的点太少，调高滴度）

6. PBS--0.05%Tween 20洗五次，各5min；（可以不用每次都夹起膜，第一次夹

起就好啦）

7. Secondary Antibody与PBS--0.05%Tween 20按1∶5000—1∶20000的比例混

合浸泡膜1hr； (我们的二抗滴度都是使用1：5000就好)

8. PBS--0.05%Tween 20洗七次（如背景太黑，需更多次），各5min； 9. Develop color：染色（ECL）、 操作注意事项：

 超作到第7次时，准备ECL的试剂，两个瓶子中的液体千万不能混淆，

头一定要换！！！否则ECL试剂盒会完全作废。每个瓶子中都取出4ml液体，共8ml反应液。(无论是一张胶，还是2张胶都只需要这么多体积的反应液，一次操作时，反应液可以重复使用。)

 配制的反应液体应在尽可能短的时间内使用，不可耗时过长。一般时5

－10分钟即可。

 将膜夹起，尽量的倒干盒中的PBST液，将膜置于盒中，将ECL反应液

倒入膜上，尽量使得反应液扑满整个膜面，或者不断的摇晃，使得液体均匀的在膜上反应。反应1分钟即可。

 将膜夹起，膜上的液体尽量吸干，将膜置于透明塑料板间，夹于casstte

中。注意操作时间不可太长，并尽量避光。

10. 曝光（cassette，10-30s）、

在暗室中将像纸抽出，每次抽出2张，将像纸盖在膜上（膜与像纸间应隔一层透明塑料板），根据荧光差异曝光10－30秒不等。可根据实验结果适当调整，重新曝光。（注：像纸抽出过程是在暗环境下进行，像纸抽出后，一定要将装有像纸的盒子关好，否则像纸曝光，全部作废！！！！） 11. develop,1min、

将像纸置于显色液中1分钟以上，手或者镊子尽量少的碰触有反应的地方，避免指纹盒镊子的痕迹污染结果。1分钟后将像纸置于自来水中洗涤少许。注：曝光和显影过程都是在暗环境中操作。 12. fix,1min、

将像纸置于定影液中，完全覆盖，后可以开灯观察结果。 13. 水洗、晾干