第五节特种光学显微镜介绍

显微镜的分辨本领取决于单色光波长及物镜的NA。物镜的最大NA= 1.6，一可推 算在白光下的最大分辨率为0.2um。在显微技术中把线度小于0 .1um的粒子称为超 显微粒子，也称微小粒子。

当强光投射到微粒上时要发生散射，由于衍射环的存在，以每个微粒为核心形 成一个发亮的衍射斑，这就是丁铎尔(tyndall)效应。若让照明光束不直接射入物 镜使视场变暗即暗场(darkfield )，则为观察丁铎尔衍射斑提供了具有一定反差的暗 背景。此条件下通过显微镜的日镜，对线径大于0.3um的微小物体能够看清其形状 和大小;对于超显微粒子或生物，虽无法分辨其形状和大小，却能通过衍射斑判断

它的存在、位置和数量。例如原生质颗粒在亮场照明时呈均匀系，在暗场下就反映

出颗粒分散的特征。标本中的超显微病毒也可以用暗场显微镜C dark field micro-scope）加以鉴别。

形成暗场是暗场显微镜的技术关键，其方法就是用侧向照明。对于透明物体的 观察，只需要在阿贝聚光器下方加上一个环形暗场光阑，挡住入射到聚光器光线的 中心部分，从而实现侧向照明。但根据所使用的物镜的数值孔径的大小情况又有不 同。对于小的物镜，如果在聚光器的最后一个光学而与载玻片间滴上镜头油，盖玻 片和物镜之间是空气，则经过聚光器的环形光束在盖玻片内被全反射而不能进入物 镜便一可形成暗视场。对于NA较大的物镜则需要专门的暗视场聚光器，基本结构是 山消球差、消色差良好的非球面透镜(组)和暗场光阑组成。

对于不透明的被观测物体，则要采用落射光照明，最简单的办法是自下方射来 的照明光束，经挡板后形成一中空光柱，再经聚光镜将光线反射后以斜光束会 聚照亮物体上的一点。山于其投射倾角很大，故反射光线不能进入物镜，只有山物 体来的散别一光进入物镜，从而形成暗视场下的明亮的放大像。在暗场照明时，观察 到的明暗影像正好.与明视场相反。

使用暗视野显微镜时，载玻片、盖玻片必须合乎标准厚度、无尘埃、无划痕; 物镜亦应清洁无尘;NA以大于0.85为宜。观察时先将聚光镜上滴以香柏油，然后 上移使之与载玻片背面接触，即将聚光镜与载玻片间充以香柏油介质。缩小视野光 阑，用10倍物镜观察找出标本并定好应观察的位置。然后再更换干式高倍物镜进 行观察。必要时可在聚光镜下安放方位光阑并转动以改变斜射光的方位进行观察。 二、荧光显微镜

荧光显微镜( fluarescenre microscope)是一种能对自发或受激发而发出荧光的样 品进行观察的显微镜，是生物医学研究的重要目视仪器之一。它应具备以下条件: 1.使用能产生短波长光的光源，如高压汞灯、高压氨灯等，也有用弧光灯或在 采用蓝色激发光时用强碘钨灯的。

2.使用激发滤光片来选择激发光的波长范围，滤光片安装十光源和聚光镜之 间。常用的滤光片有紫外光滤光片(激发光波长主要在334nm一365nrn之间)、紫色 光滤光片(激发光波长大部分为405nm一430nm之间)、蓝色光滤光片(激发光主要 为蓝色光，和一部分紫色光，波长为405nm一435nm至490nm之间)，偶尔也有用绿 色光滤光片者(激发光波长在546nm左右)。

3.聚光镜、载玻片、盖玻片和物镜应尽可能地少吸收短波长光，允许紫外光通过。 4.吸收滤光片置于标木与目镜间或罩于目镜上，阻挡紫外线进入眼睛，而只允

许荧光进入眼睛。

5.载玻片、盖玻片、封盖介质、镜油等都应不具有荧光杂质。

6.标本的固定、包埋等处理应能保存组织中的荧光物质或不产生非特异性荧光。 7.荧光显微镜应在暗室内观察，或在目镜上安装遮光罩，以阻挡外来光的干扰。 荧光显微镜的照明系统有透射和落射两种，或为二者的结合方式。由于可配合

专用聚光器又可分为明场、晴场、偏光、相差等照明方式。为了充分利用聚光器的 数值孔径，使用油镜时，应在载玻片和聚光器透镜间滴上双蒸水或甘油，以增强光 祸合，使荧光图像亮度增大。聚光镜不使用受激发而产生荧光的玻璃和加拿大胶等 材料‘来制作镜头，玻片也要用无荧光材料制作，以减少本底荧光的干扰。 三、紫外光显微镜

紫外光比一可见光的波长短，使用紫外光源一可大大地提高显微镜的分辨率。对于 生物样品使用紫外光照明还具有独特的效果。生物细胞中的原生质对可见光儿乎是 不吸收的，而蛋白质和核酸等生物大分子对紫外光却具有特殊的吸收作用。因此， 可以使用紫外光显微镜(ultraviolet microscope)来观察研究单个细胞的组成与变化情 况。例如，细胞内核酸的分布状况和在细胞发育过程中核酸的变化，未被染色的活 细胞i_y细胞质和细胞核的区分等。

紫外光显微镜一般使用10kV的水冷式高压水银灯作光源。工作光谱波长为 257nm或275nm，由于工作波长段很窄因此光强很强。普通光学玻璃强烈吸收紫外 线，因此光学透镜必须使用石英、萤石或氟化铿等制作。例如物镜就是单片的单色 镜(透镜对紫外的窗只有10nm左右)。在照明系统中使用的反射镜镀有铝层一可使紫 外光反射率在90%以上。由于紫外光是不可见的，因此必需配备光电或影像记录系 统。在使用紫外光显微镜时要保护眼睛免受紫外光线损害。紫外光显微镜的调焦也 较特殊。一是先使用辅助可见光调焦，然后再将物镜移动一个固定的距离便能保证 对紫外光调焦;二是直接用紫外光源在荧光屏上调焦。在使用中应特别注意水冷式 光源的冷却水流畅通。

四、偏光显微镜

偏光显微镜( polarising microscope)是利用光的偏振特性，对具有双折射性(即 可以使一束入射光，经折射后分成两束折射光)的晶体、液晶态物质进行观察和研 究的重要光学仪器。利用它可以清楚地观察到纤维丝、纺锤体、胶原、染色体、卵 巢、骨骼、毛发、活细胞的结晶或液晶态的内含物、神经纤维、肌肉纤维、植物纤 维等的细微结构，从而可以分析细胞、组织的变化过程。例如，正常细胞对偏振光 是左旋性的，多种肿瘤细胞却是右旋性的，通过偏光显微镜观察标木的旋光性可以 初步鉴别正常与肿瘤细胞。对于无机化学中各种盐类结晶状况，偏光显微镜的应用 领域更为广泛。

(一)结构与原理

偏光显微镜的结构是在一般显微镜的基础上增添了使普通光转变成线偏振光和 检测偏振光的装置或观察干涉图样的特殊透镜。即光源前有偏振片〔起偏器)，使 进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器(一个偏振方向与起偏器垂直的起偏 器)，这种显微镜的载物台是可以旋转的。当载物台无样品时，无论如何旋转载物 台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线。而放入旋光性物质后，由于 光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。图4一8给 出偏光显微镜的结构示意。

光源发出的自然光束经平而反光镜反射后通过起偏器转换成沿偏振片透光轴方 向的线偏振光。线偏振光经聚光镜后成平行光束投射到载物台中心圆孔而照亮标 本。载物台分为上下两层:上层能够绕轴旋转，刻有角度刻度;下层是固定的，设 有游标，配合动盘可以读出0.1°的转角值。载物台中心轴是和物镜光轴精确重合 的。镜筒结构较复杂，在物镜和目镜之间开有试板插入孔、并装有检偏镜和勃氏 镜。

起偏镜和检偏镜是同样的偏振片，都有透光轴，当光的振动面与该轴平行时才 能完全透过，与该轴垂直时则不能通过。二块偏振片的透光轴平行时，透过的光最 强;互相垂直(即正交)时则会完全消光。若在二块同轴偏振片中插入各向异性的

材料，会造成光的偏振面产生附加的转动，改变原来的正交或平行关系。一般情况 下偏光显微镜是一让二块偏振片处于正交的，可以转动载物台测出恢复正交所需的转 角的大小。

当投射到标本上的照明光束不是平行偏振光束，而是锥形偏光束(以各种倾角 入射的平行偏振光)的时候，则在目镜中所观察到的并不是样品本身的像，一是经 各向异性的样品所发生的消光和十涉的共同效果，例如在液晶结构中常出现的马一耳 他十字等。为了能看到放大的一涉像，需要在日镜前安装透镜组勃氏镜。加入勃氏 镜可以使看到的干涉图像放大但成像比较模糊。若不用勃氏镜便可取下日镜，用眼 睛也能看到干涉图象。相比之下图形小一些但清楚得多。

移相装置是偏光显微镜在使用过程中不可缺少的附件。全波片、半波片及1/4 波片可以使通过波片的偏振光分别延迟2

、

和

/2的相位。而补偿器则可连续一调

节使通过的偏振光的相位发生连续的改变。移相装置对观察光的偏振性质是十分必 要的。

(二)偏光显微镜的使用

偏光显微镜在一般情况下要把起偏器和检偏器放在正交位置上工作的。在作正 交观察时一要选用低倍P.G系列物镜，而在作锥光观察时应使用高倍物镜和相应的高 倍聚光镜。在观察细小样品的干涉图时，可缩小光圈改善观察效果。使偏光显微镜 具备较大的视场也是十分重要的。当把偏光显微镜用作定量分析时，要把目镜焦平 面上的定向十宇丝调整到和起偏镜、检偏镜的透射平面平行。由于现在采用具有很 强的二向色性(即对一两个互相垂直方向上的光振动分量具有不同的吸收性质)的碘 整齐地吸附排列在线性结构的高分子化合物片基材料(常用聚乙烯醇)_卜形成H型 偏振片或K型、L型等人工制作的偏振材料，因此不宜受潮，不可受太阳曝晒，也 不可受机械撞击和重压。在对光学元件进行维护和修理时，注意不要装配过紧使镜 头产生应变，导致性能变坏。 五、相衬显微镜

相衬显微镜的基木原理是把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高 了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏 离了原来的光路，同时被延迟了变为

(波长)，如果再增加或减少

，则光程差

，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减小，提高反差。在构造上，相衬

显微镜有两个不同于普通光学显微镜之处。

1，环形光阑(annular oiaphraGm})位于光源与聚光镜之间，作用是使透过聚光镜 的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。

2，相位板(annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，一可将直射光 或衍射光的相位推迟

，并能吸收直射光(背景光)的光强，使直射光与衍射光

的光强趋于一致，能更好地突出千涉的效果。相位板分为A+相板和B+相板两种。 相衬显微镜除聚光镜和物镜有着特殊设计外，其它结构和普通生物显微镜没有 太大差别。相衬显微镜的操作相比较而言比较复杂。使用前一调整使聚光器上的环形 光阑象与相应相板重合，再调节聚光器上光阑的位置，使光阑像与相板暗环的中心 重合，为了能够获得满意的相衬效果，要求标本较薄，并尽可能应用单色光源。图 4一9为相衬显微镜光路示意图。

六、干涉相衬_显微镜

干涉相衬显微镜(intetference contrast microscope)的优点是能显示结构的三维立 体投影影像，与相差显微镜相比，技术设计要复杂得多，其标本可略厚一点，折射 率差别更大，故影像的立体感更强。干涉相衬显微镜利用的是偏振光，有四个特殊 的光学组件:偏振器、棱镜、滑行器和检偏器。偏振器直接装在聚光系统的前面， 使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了石英wollastnm棱镜，可将一束光分解成 偏振力一向不同的两束光(x和y)，二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微 镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标木相邻的区域后，由于标木的 厚度和折射率不同，引起两束光发生光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个wol- lastaton棱镜(滑行器)，把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面(x和Y)仍然 存在，最后光束穿过第二个偏振装置(检偏器)，检偏器将两束垂直的光波组合成 具有相同偏振面的两束光，使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透射光的多 少，光程差值为0时，没有光穿过检偏器;光程差值等于波长一半时，穿过的光达 到最大值。于是在灰色的背景上，标木结构呈现出明暗差。为了使影像的反差达到 最仕状态，一可通过调节滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差一可改变影像的亮 度。调节滑行器可使标本的细微结构呈现出止或负的投影形象，通常是一侧亮，而 另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。图4一10为 干涉相衬显微镜的光路示意图。

七、近场显微镜

为了满足观察的物体越来越微小的需求，须采用波长更短的光束。从可见光到 紫外光，再到X光就一可以使显微镜的分辨率提高50倍，再发展到电子束，又比X 光显微镜的分辨率增大约25倍。但是，波长越短则能量越高，对生物样品造成的 可能损伤就越严重。20世纪80年代后期，科学家们研制出近场扫描光学显微镜 ( near - field scanning optical micrescepe )，利用可见光就可以看清约为波长十分之一大 小的微细结构，把光学显微镜的分辨率提高了5-10倍，这显然不能使用光学透镜， 近场显微镜是无透镜的。其工作原理是将一个特制的微探头移近样品使它在给定时 间内只能“看见”截面直径小于波长的很小部分，通过扫描探头巡视过整个样品， 最后整合成一幅完整的图像。

近场显微镜的微探头是一个中空的、针状的、顶部小于150nrn，内孔直径为 50nm的玻璃微管，管壁镀铝膜，最终使光线只能从直径为50nm(一可见波长的1/10 左右)的内孔射入，微管的尾部接上十分灵敏的光量子探测器测量进入内孔的光

量，这种技术的理论分辨率极限约10nrn。由于采用可见光对生物样品损害很少，而 且既可以用在空气中(与电子显微镜必须用在真空条件下相比要优越)，又可以用 在水中(与一般的光学显微镜相比也有优越性)，因此，这种光学显微镜技术将对

研究活体中的病毒和染色体等生物物质的结构和形态发挥作用。由于探测器对一可见 光是灵敏的，还可以对生物样品进行荧光分析。这种显微镜还能用来研究材料的表 面性质。目前近场显微镜尚没有商品仪器，但是随着其技术的成熟一定会在不久的 将来，成为光学显微镜中的一个新成员。

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