江苏农业科学２０１２年第４０卷第６期 一２９一 王俊生，范小芳，李成伟，等．小麦Ｔａ—ＵＢＸ１基因的电子克隆和生物信息学分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０１２，４０（６）：２９—３２ 小麦Ｔａ—ＵＢＸ１基因的电子克隆和生物信息学分析 王俊生，范小芳，李成伟，谭光轩 （周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室／周口师范学院生命科学系，河南周口４６６０００） 摘要：用电子克隆方法获得了１个小麦Ｕ—ｂｏｘ蛋白基因Ｔａ—ＵＢＸ１，采用生物信息学方法，对该基因编码蛋白从 氨基酸组成、基本理化性质、跨膜结构域、疏水性／亲水性、亚细胞定位、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析。 结果表明：小麦 一ＵＢＸ１基因全长２０５９ ｂｐ，具有完整的ＯＲＦ编码框，编码５５３个氨基酸；在Ｎ端存在１个显著的 ＵＢＸ保守结构域，该蛋白序列不存在跨膜区或信号肽；生物信息学分析表明，在序列组成、高级结构及活性位点等方 面，与其他禾本科植物的同类Ｕ—ｂｏｘ蛋白具有高度的相似性。 关键词：小麦；Ｕ—ｂｏｘ ｄｏｍａｉｎ蛋白基因；电子克隆；生物信息学 中图分类号：Ｑ７５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２—１３０２（２０１２）０６—００２９—０４ 泛素一２６Ｓ蛋白酶体途径是真核生物体内一种高度选择 关于植物Ｕ—ｂｏｘ蛋白基因序列的报道较多，但有关小 性的蛋白降解途径，这一途径中包括了Ｅ１、Ｅ２和Ｅ３等３种 麦Ｕ—ｂｏｘ蛋白基因克隆的研究目前尚未见报道。本研究在 酶。其中泛素连接酶Ｅ３起着底物蛋白特异性识别的关键作 前期工作基础上 ，以１个在小麦生理型不育花药中上调表 用，且种类最多 。泛素连接酶Ｅ３被分为３种类型： 达的差异ｃＤＮＡ片段（ ６９）序列作为种子序列，利用电 ＨＥＣＴＥ３、ＲＩＮＧ—ｆｉｎｇｅｒ Ｅ３、Ｕ—ｂｏｘ Ｅ３。Ｕ—ｂｏｘ域是决定 子克隆技术，克隆了１个小麦Ｕ—ｂｏｘ ｄｏｍａｉｎ蛋白，并利用生 Ｕ—ｂｏｘ Ｅ３酶活性的主要结构域，它的突变或碱基替换将使 物信息学相关软件对其进行生物信息学综合分析，为进一步 该蛋白的Ｅ３酶活性丧失 。Ｕ—ｂｏｘ结构是一类广泛存在于 研究在小麦发育过程中的调节作用提供理论基础。 真菌、植物和动物中的高度保守的基序，最初是在泛素链聚集 酶Ｅ４的原型——酵母中的蛋白ＵＦＤ２的碳末端鉴定出来 １材料与方法 的 。目前已鉴定出的真核生物的Ｕ—ｂｏｘ蛋白中，酵母体 １．１ 小麦Ｕ—ｂｏｘ蛋白基因的电子克隆 内发现２种，动物中有６种，而拟南芥中有３７种该类蛋白 Ｊ。 以差异显示技术获得的基因片段ＴＤＦ２６９在小麦ＥＳＴ数 有研究表明，植物Ｕ—ｂｏｘ蛋白参与了植物体内细胞发 据库中进行同源检索，将得到的高度相似的ＥＳＴ序列用 育、信号转导和光周期反应等重要生理活动。如烟草中的 ＢＩＯＥｄｉｔ进行拼接，获得重叠群ｃｏｎｔｉｇｌ，将ｃｏｎｔｉｇｌ反复对 Ｕ—ｂｏｘ／ＡＲＭ重复蛋白ＮｔＰＵＢ４参与植物发育信号通路的调 ＧｅｎＢａｎｋ的ＥＳＴ数据库进行检索拼接，直至没有新的ＥＳＴ入 控，表达具有时间性和空间性 ，马铃薯Ｕ—ｂｏｘ／ＡＲＭ重复 选，从而生成最后的新生序列，作为ＥＳＴ的延伸产物。 蛋白——光周期反应蛋白（ＰＨＯＲ１）参与信号传导，是赤霉 １．２小麦Ｕ—ｂｏｘ蛋白的生物信息学分析 素（ＧＡ，）信号传导途径中的正向因子 ；另外，植物Ｕ— １．２．１基因序列分析利用ＯＲＦ ｆｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ． Ｂｏｘ蛋白质在抵抗干旱、高盐、异常温度等非生物胁迫时发挥 ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）在线工具预测其开放阅读框；并用软件Ｐｒｉｍｅ５ 作用 也有越来越多的证据表明Ｕ—Ｂｏｘ蛋白质与植物的抗 翻译其氨基酸序列。 病相关。例如拟南芥的ＡｔＰＵＢ９与ＡＢＡ信号相关 ，烟草 １．２．２理化性质分析蛋白质的疏水性分析利用ＥｘＰＡＳｙ （Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）与番茄（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）的 网站的ＰｒｏｔＳｃａｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｃｎ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｅｇｉ—ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ． ＣＭＰＧ１基因参与多个抗病基因介导的抗性反应 ；超表达拟 ｐ１）在线分析；等电点和分子量计算采用Ｃｏｍｐｕｔｅ ＰＩ／ＭＷ ｔｏｏｌ 南芥的ＰＵＢ２２和ＰＵＢ２３使其对干旱胁迫的敏感性增加 ， （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ—ｔｏｏ１．ｈｔｍ１）。 拟南芥Ｕ—ｂｏｘ Ｅ３泛素连接酶ＡｔＰＵＢ１９在干旱胁迫、盐胁 １．２．３细胞定位、磷酸化、跨膜区和前导肽分析以ＷｏＬＦＰ— 迫、寒冷和ＡＢＡ胁迫下上调表达，该蛋白的下调表达会导致 ＳＯＲＴ进行亚细胞定位分析；ＮｅｔＰｈｏｓ ２．０ Ｓｅｒｖｅｒ预测磷酸化 拟南芥的ＡＢＡ脱敏反应，增加了ＡＢＡ诱导的气孔关闭和耐 作用位点，ＴａｒｇｅｔＰ １．１ Ｓｅｒｖｅｒ预测氨基酸前导肽的细胞定位。 干旱性 …；水稻ＳＰＬ１１蛋白，烟草、番茄、欧芹等植物中的 １．２．４二级结构、跨膜结构以及进化树构建以ＳＯＰＭＡ和 ＣＭＰＧ１蛋白，拟南芥中的ＡｔＰＵＢ１７及其在烟草中的功能同源 ＴＭＨＭＭ方法进行蛋白二级结构和跨膜结构分析。用ＮＣＢＩ 物ＡＲＣＥ２７６等都可参与抗病反应 ”Ｊ。 的ＢＬＡＳＴｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）序 列比对工具比对同源性，利用ＤＮＡｍａｎ软件构建进化树。 收稿日期：２０１１—１０—１２ ２结果与分析 基金项目：河南省基础与前沿技术研究（编号：１１２３００４１０１２７）。 作者简介：王俊生（１９７０一），男，陕西蒲城人，博士，副教授，从事小麦 ２．１ 小麦Ｕ—ｂｏｘ ｄｏｍａｉｎ蛋白基因的电子克隆及其序列 雄性不育与油菜遗传育种研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｊｓ００９９＠１６３．ｃｏｒｎ。 分析 通信作者：李成伟，博士，教授。Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｃｈｅｎｇｗｅｉ＠ｚｋｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。 以小麦序列ＴＤＦ２６９作为种子序列，利用软件ＢＩＯＥｄｉｔ电 一３Ｏ一 江苏农业科学２０１２年第４０卷第６期 ＡＡＡＡＴＧＣＡＡＣ 兀’ＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＣＴＹＧＡＧＴＣＣＡＡＴＣＴｒＧＣＣＧＣ 子克隆获得了１个最终长度为２ ０５９ ｂｐ的重叠群，利用ＮＣＢＩ 中提供的ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ软件对该序列进行开放阅读框预测，发 现在１１３～１ ７７４ ｂｐ之间存在１个最大的开放阅读框，编码 ５５３个氨基酸，含有起始密码子ＡＴＧ和终止密码子ＴＡＧ，并 且具有植物Ｕ—ｂｏｘ蛋白基因的Ｕ—ｂｏｘ基序。以推导的氨基 ＣＡＡＡＧ从ＧＣＡＴＣＡＴＩ１０ＣＣ ＩＴｃｃＡＧＣＣＡＣＣＴｒＣＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＧ （ ＧｒＩ’Ｉ１ＡＴＡＡＣＡＣ Ｉ’Ｉ１ＧＴＡＧＴＴＣＧＣＡＴＧＣＣＴＧＡＣＧＧＴＡＧＴＣＧＡＣＡＧ ＧＧＧＣＧＴＣＧＣＴ Ｉ－ＩＷＡ Ａ Ａ ＡＴＣＴＧＡＴＡ Ａ ＡＴＴＣＡＡＧＴＣＣＣＴＴＴｒｒＧＡＴ 兀ｌＣＴＴＡＧＡＣ 【ＴＩ１ＧＧＣＡＧＧＡＣＴｒａ：ＡＡＧＣＣＡＧＡ Ａ ＡＣＣＴＡＣＡＧＡＣＴ ＧＧＴＡＡｏＧＡＣＡＴＡＣＣＣＣＡＧＧＣＧＴＧＣ ＡＣＣＡＣＴＧＣＴＧＡＣＧＧＣＧ 酸序列对非冗余蛋白质数据库进行ＢＬＡＳＴ检索，获得了不同 植物Ｕ—ｂｏｘ蛋白的氨基酸序列，证明电子克隆延伸产物和推 导的氨基酸序列是合理的，因此命名该基因为Ｔａ—ＵＢＸ１。该 基因碱基序列：ＧＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴＣＴＹＧＡＧＣＣＴＣＣＧＡＧ１＿ＩＴＧＧＣｒＩ’Ｉ＇Ｃ ＴＣＣＣＡＣＡＣＧＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＴＴＣＴＣＴ（ ＧＴＧＡＧＡ ＧＣＧＴＣＧＣＧＴＣＣＡＡＡＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＣ￣ＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＴＣＡＴＩＴｒＡＣＴＧＡＴＣＴＣＧＧ（ ＴＡＡＣＡＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣ ４ Ｇ 刀ＡＣ 翻劢 ＧＧＧ￣ＧＡＴＩ＇ＣＡＧＣ ＣＧＣＡＣＣＴＡＧＧＧＡＴＡＣＣＡＣＣＡＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＴｒＧＧＧＧＴＩＴｒＡＣ ＧＴＣＴＡＴＡＣＴＹＧＣ ￡ ｎ 吼 ＧＧＧ ＧＧ ＡＴＣＴ０ＧＡ ＡＣＧ ＴＣＴＧＴＧＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＡＡ ．．．．．．．．—— ＣＧＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＣＴＡＴＣＧＡＣＡＣＣ Ｉ’Ｉ℃ＡＴＣＡＧＣＡｒＩ、ＣＡＣＣＧＧＧＧＣＣ ＧＡＣＧＡＧＧＣＣＧＴＣＧＣＣＡＴＣＣＧＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＧＡＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧ ＡＣＣＴＣＡＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＣＡＡＴＧＣＡＣＡＣＴｒＣＡＣＴＧＡＡ０ＧＡＧＡＴＡＧＣ ＡＣＡＧＴＧＡＡＣＧＣＡＡＴＣＡＡＴＣＡ从ＧＴＡｒＩｒＩ℃ＣＡＣＣＴＧ，Ｉ－Ｉ’ＡＡＴＣＡＴＧＡ ＴＧＡＴＡＴＯＣＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＡＣＣＡＣ 兀 ＡＴ从ＣＡＣＧ，ＩＴＩＴＣＡＡＡＧＡＣ ＣＧｒＴＧｒＴＣＣＣＴＧＡＡ０ ＣＴＧＣＡＴＧＡＣＣＣＴｎ＝ｒＩ．ＧＣＡＣＴＡＡＴＧＧＡＴＣ ＣＣＡＡＴＩＴＣＣＡＧＣＡＡＡＴＧ１’ｒｒｒｒｒＧＡＴＡ Ａ ＧＴＴＣＧＣＡＴＣＣｒＩＴＩＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＴＡＧＧＧＧＧＴＡＴＡ Ａ Ａ ＡＣＡＧＴＧＡＴＣ ＡＧＣＡＡＣＯＧＡＴＣＣＡＧＧＡＴＡＴＩＴＩ１ＧＧＴｒＡＴＧＡＡＴＧＣＧＣＧＣＴＡ０ＣＧＣＡ ＧＣＧＡＴＡＡＴＣＡＴＴＧＴＴＣＧｒＩＴＩＴＩ＇ＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡ ＩＴＣＣＴＧＧＴ兀’ 翻译氨基酸序列：ＭＡＲＰＱＱＥＡＩＤＴＦＩＳＩＴＧＡＤＥＡＶＡＩＲＫＬＥＥ ＨＡＧＤＬＮＱＡＶＮＡＨＦＴＥＧＤＳ］ｎ Ａ－ＩＮＱＳＩＰＰＶＮＨＤＤＭＥＩ ＧＰＬＤＮＴ ＦＱＲＰＬＦＰＥＡＬ皿ＰＥ ＬｈⅡ）ＰＮＦＱＱＭＦＦＤＳＶＧＳＡＧＴＰＮＲＤＡＱＧＰ王｛ＰＲ 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ＧＧ ＬＲＥＱＱＤＤＥⅥ．ＡＳＬＱＡＤＱＥＫＥＭＫＴＬＱＥＡＥＬＲＩ．Ｉ ＥＴ从ＲＥＡＡＬＥＫ ＱＲＱＥＥＥＥＱＲＫＭＱＬＥＫＥＥＬＥＳＮＬＡＡＫＥＡＳＬＰＬＥＰＰＳＤＫＥＧＶＩＴＬＷ ＲＭＰＤＧＳＲＱＧＲＲＦＬＫＳＤＫＦＫＳＬＦＤＦＬＤＶＧＲＴＣＫＰＥＴＹＲＬＶＲＴＹＰＲ ＲＡＦＩ￣ＡＤＧＤＱＳＦＴＤＬＧＬＴＳＫＱＥＡＬＦＩＥＱＩＴＤｏ ２．２生物信息学分析 ２．２．１小麦 ｒＡ—ＵＢＸ１蛋白理化性质分析利用Ｐｒｏｔｐａｒａｍ 工具预测该蛋白质的基本理化性质，表明该蛋白质分子式为 ｃ Ｈ Ｎ Ｏ， ：Ｓ ，相对分子量为６１ ３０２．０，理论等电点 （Ｈ）为４．４４，含有２０种基本氨基酸，含量较高的是Ｇｌｕ （１１．８％）和Ｓｅｒ（８．３％），含量较低的是Ｃｙｓ（０．２％）和Ｔｒｐ ＧＡＧＧＡＡＣＡＴＧＡＴＧＡＡＧＣＴＧＴｒＡＴＧＣＴｒＧＡ０ ＴＧＣＡ Ａ ＴＩ肼（０．２％），带负电荷残基７６个（１９．８％，包括Ａｓｐ、Ｇｌｕ），带正 电荷的残基６３个（９．ｏ４％，包括Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）（表１）。该蛋 白质水溶液在２８０ ｎｍ处的吸光系数为１５ ９３０。该蛋白的不 稳定系数为６３．４１，为不稳定蛋白，这可能是功能不明的原因 ＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＣＣＡＡＣＡＴＡＴＣＣＡＴｒＡＴＣＴＣＡＴ００ＧＡＧＣＴ ＣＧＡＧＴＣＡＴｒＡＴＣＣＣＣＡＡＧＴＡＧＴＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡ Ａ ＩＴＧ ＡＣＴＧＡＡＣＡＡＣＧ 【ＴＩ’Ａ ＩＴＩ１ＡＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣＡＯＧＡＴＧＡＴＧＡｅＴＡＣＣＴ ＴＧＣＡＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＩＩＣＴＡＣ ＡＡＧＡＡＧＣＴＣＡＧＣＴＣＡＧＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡ Ａ ＡＣＴａ： ｒ（ ＡＡＧＡＧＡ ＡＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＡＧＡ从ＣＡＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡ（ Ａ ＡＣＡＧＣＧＴ 之一。脂肪系数为６８．３２，平均总亲水性为一０．８１４，表明该 蛋白总体上亲水性和疏水性比较平衡。 表１小麦Ｕ—ｂｏｘ蛋白氨基酸组成 氨基酸 Ａｌａ（Ａ）Ａｒｇ（Ｒ） Ａｓｎ（Ｎ） Ａｓｐ（Ｄ）Ｃｙｓ（Ｃ）比例（％） ８．０ ６．５ ３．８ ８．０ ０．２ 氨基酸 Ｇｉｎ（Ｑ） Ｇｌｕ（Ｅ） Ｇｌｙ（Ｇ） Ｈｉｓ（Ｈ１ ｎｅ（Ｉ 比例（％） ６．１ １１．８ ５．８ ２．４ ４．２ 氨基酸 Ｌｅｕ（Ｌ）Ｌｙｓ（Ｋ） Ｍｅｔ（Ｍ） Ｐｈｅ（Ｆ） Ｐｒｏ（Ｐ１ 比例（％） ８．０ ２．５ ２．４ ３．１ ７．４ 氨基酸 Ｓｅｒ（Ｓ１ Ｔｈｒ（Ｔ、 ’ （Ｗ）Ｔｙｒ（Ｙ） Ｖａｌ（Ｖ）比例（％） ８．３ ５．８ ０．２ １．３ ４．５ 氨基酸 Ｐｙｌ（０）Ｓｅｃ（Ｕ）Ａｓｘ（Ｂ）Ｇｌｘ（ｚ）Ｘａａ（Ｘ）比例（％） ０．０ ０．０ ０．０ ０．０ ０．０ ２．２．２ 亚细胞定位、跨膜区和前导肽分析 利用软件 构域是膜中蛋白与膜脂结合的主要部位，一般由２Ｏ个左右的 疏水氨基酸残基组成，形成螺旋与膜脂相结合。预测和分析 跨膜结构域对认识蛋白质的结构、功能、分类以及在细胞中的 ＳｕｂＬｏｅ１．０对其进行亚细胞定位分析，表明该蛋白质位于细胞 核（Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ＝１；Ｅｘｐｅｃｔｅｄ Ａｃｃｕｒｃｙ：５６％）。跨膜结 王俊生等：小麦Ｔａ—ＵＢＸ１基因的电子克隆和生物信息学分析 作用部位均有一定的意义。利用ＨＮＮＴＯＰ和ＴＭＨＭＭ法对 该蛋白氨基酸序列进行跨膜区预测，表明小麦Ｔａ—ＵＢＸ１蛋 白不存在跨膜区或信号肽（图１）。这与利用“ＤＡＳ”一Ｔｒａｎｓ— ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｓｅｒｖｅｒ对该蛋白跨膜结构预测的结果一 一３１一 酸化作用位点，表明该蛋白具有２６个丝氨酸磷酸化作用位点 量∞茸∞ＩＩＤ ０】 工ａ薯。∞ｌｐ （Ｓｅｒ：２６）、１４个苏氨酸磷酸化作用位点（Ｔｈｒ：１４）和２个酪氨 一 一酸磷酸化作用位点（Ｔｙｒ：２），具有多个不同的磷酸化作用位 点。利用ＢＬＡＳＴｐ检索非冗余蛋白质数据库，表明该蛋白在 Ｎ端存在１个显著的ＵＢＸ ｄｏｍａｉｎ（图２），属于ＵＢＱ超级家族 （ｃ１００１５５）中的ＵＢＸ域包含蛋白（ｐｆａｍ００７８９），这类蛋白的功 能目前绝大多数尚不清楚。 ２．２．４蛋白质二级、三级结构预测（１）Ｔａ—ＵＢＸ１蛋白二 致，即该蛋白不存在任何严谨的跨膜结构，也不存在导肽序 列。表明Ｔａ—ＵＢＸ１蛋白主要在细胞核中起作用，与细胞质 缺乏联系。 级结构预测。利用软件ＳＯＰＭＡ对小麦Ｔａ—ＵＢＸ１蛋白二级 结构预测表明，该蛋白质序列中 螺旋占３７．２５％，扩展束占 ７．５９％， 转角占３．８０％，无规则卷曲占５１．３６％。（２） Ｕ—ｂｏｘ蛋白紊乱区、球蛋白区预测。利用ＧｌｏｂＰｌｏｔ软件（ｈｔ— ｔｐ：／／ｇｌｏｂｐｌｏｔ．ｅｍｂ１．ｄｅ／）对小麦Ｕ—ｂｏｘ蛋白序列中的紊乱 区、球蛋白区进行预测，结果（图３）显示该蛋白存在９个不稳 氨基酸位置 图１ 小麦Ｕ—ｂｏｘ蛋白跨膜结构预测 定区，分别位于５１～７７，９９～１３４，１４１～１５３，１７７～１９５，２５７～ ２７３，２９６—３３８，３５７—３８１，４６２～４６９，５２８～５３５氨基酸位置。 由于这些位置的可变性，很可能参与该蛋白的酶活性或者蛋 ２．２．３ Ｔａ—ＵＢＸ１蛋白磷酸化和保守域分析蛋白质磷酸 白相互作用，在探寻蛋白功能机制时应当重点关注；在３８２— ５５０位置处为潜在的球蛋白区，这一球形蛋白区氨基酸相对 稳定，并且Ｕ—ｂｏｘ域也处在这一球形区。 ３００ ３７５ ４５０ ５２５ ５５３ 化是最普遍、最重要的一种翻译后修饰，几乎调节着生命活动 的整个过程，因此磷酸化分析对了解蛋白质可能的功能具有 重要意义。利用ＮｅｔＰｈｏｓ ２．０ Ｓｅｒｖｅｒ预测小麦Ｕ—ｂｏｘ蛋白磷 ｌ ７５ ｌ５Ｏ ２２５ ｂ 帕 ｋ ＂ ｉ 豳图２ Ｔａ—ＵＢＸＩ蛋白保守结构域 类，结果与传统的分类基本一致。 ０．９ ３讨论 ４．２ 电子克隆是随着基因组计划和ＥＳＴ计划的实施而发展 －９．４ 起来的，电子克隆是利用生物信息学手段进行基因克隆的新 方法，它具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优 点 。利用电子克隆技术克隆新的基因尽管受到某物种 ｌ４．５ １９．６ ＥＳＴ数据库信息量的，但近年来的高通量测序技术使得 小麦ＥＳＴ数据库中的序列迅速增加，为本研究的完成提供了 良好的材料基础。电子克隆获得的基因序列还需要通过实验 进一步验证正确性。 ２４．７ Ｏ ５０ １ｏ０ ｌ５０２００ ２５０ ３００ ３５０４００４５０ ５００ ５５０ 氨基酸位置 图３ 小麦Ｕ—ｂｏｘ蛋白球蛋白区和紊乱区预测 本研究从小麦ＥＳＴ数据库中克隆得到的小麦 Ｔａ—ＵＢＯＸ１基因全长２ ０５９ ｂｐ，具有完整的蛋白质编码框，编 码５５３个氨基酸，不存在信号肽和导肽结构，也不具有跨膜结 构，是位于细胞核中的不稳定蛋白；具有多个不同的磷酸化作 用位点。该基因具有典型的ＵＢＸ结构域，与其他禾本科作物 相同蛋白的氨基酸序列相似性较高，保守性较强。今后我们 将根据该基因序列设计引物，研究小麦发育的不同时期在各 器官或组织中的表达情况，以探索其具体功能。 参考文献： ［１］Ｍｏｏｎ Ｊ，Ｐａｒｒｙ Ｇ，Ｅｓｔｅｌｌｅ Ｍ．Ｔｈｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ—ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｏｎｌｉｎｅ，２００４，１６（１２）：３１８１— ３１９５． ２．２．５与水稻等禾本科同源蛋白的比较小麦Ｔａ—ＵＢＸ１ 蛋白的氨基酸序列与水稻、玉米、高梁以及大麦几种禾本科植 物同源的Ｕ—ｂｏｘ蛋白氨基酸序列同源比对结果显示，蛋白质 序列的相似性分别达到７０％、６６％、６８％和９２％。运用ＤＮＡ— ｍａｎ软件对以上几种禾本科植物该蛋白氨基酸序列进行多重 比较（图４），发现禾本科植物该类蛋白氨基酸序列总体上比 较保守，尤其在这类蛋白Ｃ末端的球型区氨基酸序列高度保 守，预期形成稳定的球型蛋白结构执行其功能。对几种禾本 科植物该蛋白氨基酸序列进行进化分析（图５），结果表明，小 麦Ｔａ—ＵＢＸ１蛋白与大麦亲缘关系最近，首先聚为一类，高粱 与玉米亲缘关系最近，聚为一类，之后这２类与水稻归为一
