动物医学进展。２０１４，３５（４）：６６—７１ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒 双重ＲＴ—ＰＣＲ鉴别检测方法的建立及应用 漆世华 ，谢红玲ｈ 李晶梅 ，刘 丹 ，薛 霜 秦红刚 ，陈其兵 ，靖志强 ，，（１．武汉中博生物股份有限公司 湖北武汉４３００７０；２．中国兽医药品监察所，北京１０００８１） ，摘 要：猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒同属于黄病毒科瘟病毒属，在基因组序列上有很高的同源性，２ 种病毒交叉污染的情况十分严重，给疫病诊断和疫苗质量控制带来很大麻烦。为了更好的对这２种病的病 原进行分子生物学鉴别检测，参考ＧｅｎＢａｎｋ上２种病毒标准株的基因组序列，选取各自的保守基因区域设 计可以进行鉴别检测的特异性引物，经过对ＰＣＲ反应条件的优化，建立了可以对２种病毒同时检测的双重 ＲＴ—ＰＣＲ方法。该方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪日本脑炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、 猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒２型的扩增结果均为阴性；该检测方法的敏感性为５ ｎｇ病毒基因组 ＲＮＡ。建立的猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重ＲＴ—ＰＣＲ检测方法特异性强、敏感性高，可以用于２种疫 病的临床分子检测，也可用于猪瘟疫苗的质量控制，为２种病毒的交叉污染的检测提供一种方便、快捷的 方法。 关键词：猪瘟病毒；牛病毒性腹泻病毒；双重ＲＴ—ＰＣＲ；鉴别检测 中图分类号：￥８５２．６５１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５０３８（２０１４）０４—００６６—０６ 猪瘟（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ，ＣＳＦ）俗称“烂肠 接触性传染病，具有高度传染性和致死性，给全球 养猪业造成了巨大的经济损失，是威胁我国养猪业 瘟”，是由猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）引起的一种急性、发热、 收稿日期：２０１３—１１－０５ 作者简介：李晶梅（１９８２一），女，辽宁沈阳人，硕士，主要从事兽用疫苗研究。＊通讯作者 豢杀豢靠枭杀枭谁 豢靠豢杀粜杀粜靠粜豢岽米半张 ［１１］卫菊，王椿．从ＢＣＬ一２凋亡抑制因子家族的中寻找 癌症治疗的新途径［Ｊ］．世界ｌ｝缶床药物，２００６，２７（５）：２７０ ２７３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ Ｉｎｊ ｅｃｔｉｏｎ ｏｎ Ｓｐｌｅｅｎ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｍｉｃｅ ＷＡＮＧ Ｓｈｕ—ｓｈｕ ，ＷＡＮＧ Ｚｉ—ｎａｎ ，ＺＨＡＯ Ｚｉ—ｍｉｎｇ ，ＷＥＩ Ｘｉａｏ—ｙｏｎｇ ， ＤＵ Ｔｉｅ—ｌｉａｎｇ ．ＬＩ Ｌｉｎ—ｌｉｎ。。ＹＡＮＧ Ｑｉａｏ—ｈｏｎｇ （１．Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，５１０４０５，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ＴＣＭ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，５１００９５，Ｃｈｉｎａ； ３．ＳｏｕｔｈｅｒｎＭｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，５１０５１５，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｉｎｊ ｅｃｔｉｏｎ（ＡＩ）ｏｎ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｓｐｌｅｅｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｂｙ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｄｅｘ），７２ ＫＭ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｓｉｘ ｇｒｏｕｐｓ：ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一２ ｇｒｏｕｐ（５ ＩＵ／ｋｇ），ｈｉｇｈ ＡＩ ｇｒｏｕｐ（２ ｇ／ｋｇ），ｍｉｄｄｌｅ ＡＩ ｇｒｏｕｐ（１ ｇ／ｋｇ）ａｎｄ ｌｏｗ ＡＩ ｇｒｏｕｐ（０．５ ｇ／ｋｇ）．Ｂｅｓｉｄｅｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｍｉｃｅ ｉｎ ｏｔｈｅｒ ｆｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｉｎ— ｅｃｔｅｄ Ｄｅｘ ５ ｄａｙｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅ１．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＡＩ ｏｎ ｔｈｅ ｓｐｌｅｅｎ ｉｎｄｅｘ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉ— ｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｐｌｅｅｎ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ，Ｃａｓｅｐａｓｅ一３ ａｎｄ ＰＣＮＡ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ＡＩ ｃａｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ａｔｒｏｐｈｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｌｅｅｎ，ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｓｐｌｅｅｎ ｉｎｄｅｘ（Ｐ＜０．０５）；ＡＩ ｃａｎ ｓｉｇｎｉｆｉ— ｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｌｅｅｎ ａｎｄ ｓｐｌｅｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：Ａｌｓｏ ＡＩ ｃａｎ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一３．ｗｈｉｌｅ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＣＮＡ（Ｐ＜０．０５，Ｐ％０．０１）．ＡＩ ｈａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ａｎｔｉ—ｓｐｌｅｅｎ ａｔｒｏ— ｐｈｙ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｓｐｌｅｅｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ａｎｄ ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｍａｙ ｂｅ ｂｙ ｄｏｗｎ Ｃａｓｐａｓｅ一３ ａｎｄ ｕｐ ＰＣＮＡ ｒｅｌａｔｅｄ—ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔｃｙ；ｓｐｌｅｅｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｍｏｕｓｅ 李晶梅等：猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重ＲＴ—ＰＣＲ鉴别检测方法的建立及应用 ６７ 的最重要的传染病之一ｌ＿】 ］。牛病毒性腹泻（Ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ，ＢＶＤ）又称黏膜病（Ｍｕｃｏｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ， ＭＤ），是由牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）引起的以牛 发热、黏膜糜烂溃疡、腹泻、咳嗽及怀孕母牛流产或 产出畸形胎儿为主要特征的传染病，各种年龄的牛 都易感染，以幼龄牛易感性最高ｌ＿３ ］。近年来，猪源 牛病毒性腹泻病毒感染常有发生，猪感染ＢＶＤＶ后 可产生类似慢性猪瘟的临床症状和病理变化，干扰 猪瘟的临床诊断＿５。］。 对于猪瘟的防控通常采用猪瘟兔化弱毒疫苗 （Ｃ株）进行接种预防，该疫苗是世界上公认的最有 效和安全的弱毒疫苗，对猪瘟的防控起到了重要的 作用 ］。但猪瘟的免疫却常常出现免疫失败现象， 这与猪瘟疫苗的质量控制有重要关系。猪瘟细胞苗 在生产过程中要用牛血清、牛睾丸、胰酶等原材料， 若其中含有ＢＶＤＶ就会造成猪瘟疫苗污染外源病 毒ｌｇ。 。因此，准确地检测ＣＳＦＶ与ＢＶＤＶ，对２种 疫病的控制及猪瘟疫苗的质量控制均尤为重要。 本研究根据ＣＳＦＶ和ＢＶＤＶ ２种病毒的５ 端 保守区设计合成特异性的鉴别引物，建立了检测猪 瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的双重ＲＴ—ＰＣＲ方法， 为２种疫病的分子诊断以及猪瘟疫苗的质量控制提 供一种方便、快捷的鉴别检测方法。 １材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 病毒ＣＳＦＶ，ＢＶＤＶ，猪繁殖与呼吸综合征 病毒（ＰＲＲｓＶ），猪日本脑炎病毒（ＪＥＶ），猪伪狂犬 病病毒（ＰＲＶ），猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ），猪传染 性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ），猪圆环病毒２型（ＰＣＶ一２）， 由武汉中博生物股份有限公司保存。 １．１．２ 主要试剂Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶，Ｍ—ＭＬＶ反 转录酶，ＥｃｏＲ工与ＨｉｎｄⅢ内切酶，Ｔ４ ＤＮＡ连接 酶，克隆载体ｐＭＤ１８一Ｔ，宝生物工程（大连）有限公 司产品；病毒核酸提取试剂盒，胶回收试剂盒，质粒 提取试剂盒，天根公司产品；ＤＮＡ分子量标准， Ｔｒａｎｓ Ｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ公司产品。 １．１．３ 引物的设计、合成 根据ＧｅｎＢａｎｋ上ＣＳ— ＦＶ、ＢＶＤＶ毒株的基因组序列（登录号分别为 ＡＦ０９１５０７．１和ＡＪ５８５４１２），选择病毒的保守基因， 利用Ｏｌｉｇｏ６．０引物设计软件各设计了一对检测引 物（表１），引物由宝生物工程Ｃｋ连）有限公司合成， 工作液浓度２０／ｌｍｏｌ／Ｌ。 １．２ 方法 １．２．１病毒基因组的提取及ｃＤＮＡ合成 分别提 取１．１．１中所述病毒基因组ＲＮＡ，分别以ＣＳＦＶ、 ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ和ＢＶＤＶ混合物基因组ＲＮＡ为模 板进行反转录，所得ｃＤＮＡ模板置于一２０℃保存 备用。 表１引物序列 Ｔａｂｌｅ ｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ 病毒 引物序列 扩增长度／ｂｐ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｌｅｎｇｔｈ ＣＳＦＶ Ｐｌ（５ 一３ ）：ＴＡＣＡＣＧＡＴＴＧＧＡＣＡＡＡＴＣＡＡＡ ３５５ Ｐ２（５ 一３ ）：ＡＡＣＴＣＣＡＴＧＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＧ ＢＶＤＶ Ｐ３（５ 一３ ）：ＡＴＴＣＧＴＣＡＧＴＧＧＴＴＣＧＡＣ １５３ Ｐ４（５ 一３ ）：ＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＣＴＡＴＣＡ １．２．２ ＰＣＲ反应体系的建立 分别加入引物Ｐ１、 Ｐ２各０．５ Ｌ（或引物Ｐ３、Ｐ４各０．５ Ｌ；或引物Ｐ１、 Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４各０．５ Ｌ），ｃＤＮＡ ２ Ｌ，Ｅｘ Ｔａｑ（５ Ｕ／ Ｌ）０．５ Ｌ，１０×Ｅｘ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ ５ Ｌ、ｄＮＴＰ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）５ Ｌ，加水至５０ Ｌ。 ＰＣＲ扩增参数为：９５℃５ ｍｉｎ；９４。Ｃ ３０ Ｓ，５Ｏ℃ ～６Ｏ℃３０ Ｓ，７２。Ｃ ３０ Ｓ，３５个循环；７２℃１０ｒｎｉｎ。 １．２．２．１ ＣＳＦＶ ＰＣＲ反应体系的建立 以猪瘟病 毒基因组ＲＮＡ反转录产物为模板优化反应的退火 温度。 １．２．２．２ ＢＶＤＶ ＰＣＲ反应体系的建立 以牛病毒 性腹泻病毒基因组ＲＮＡ反转录产物为模板优化反 应的退火温度。 １．２．２．３双重ＰＣＲ反应体系的建立 以猪瘟病毒 和牛病毒性腹泻病毒基因组ＲＮＡ反转录产物为模 板，１．２．２．１和１．２．２．２优化的反应退火温度，建立 反应体系。 １．２．３ ＰＣＲ扩增产物的鉴定 分别取ＣＳＦＶ、 ＢＶＤＶ及ＣＳＦＶ和ＢＶＤＶ混合基因组ＲＴ—ＰＣＲ扩 增产物５肚Ｌ进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段的 有无及片段大小。分别将ＣＳＦＶ、ＢＶＤＶ扩增片段 连接到ｐＭＤ１８一Ｔ克隆载体，构建克隆质粒，经 ＥｃｏＲ Ｉ／ＨｉｎｄⅢ双酶切鉴定正确后送上海生工生 物工程技术服务有限公司进行测序。将测序结果与 ＧｅｎＢａｎｋ上登录的核酸序列进行对比分析。 １．２．４ 特异性试验 按照１．２．１进行ＲＮＡ提取 并反转录获得ＰＲＲＳＶ、ＪＥＶ、ＰＥＤＶ、ＴＧＥＶ基因组 ＲＮＡ的ｃＤＮＡ；ＤＮＡ提取试剂盒提取ＰＲＶ、ＰＣＶ一２ 基因组ＤＮＡ；以上述ｃＤＮＡ和ＤＮＡ作为模板，按 １．２．２．３确定的最佳反应条件进行ＰＣＲ扩增，确定 该检测方法的特异性。 １．２．５敏感性试验将提取的ＣＳＦＶ和ＢＶＤＶ的 基因组ＲＮＡ定量，然后１０倍梯度稀释到１０一，混 李晶梅等：猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重ＲＴ—ＰＣＲ鉴别检测方法的建立及应用 ６９ ２．３ 双重ＲＴ—ＰＣＲ特异性试验结果 双重ＰＣＲ检测方法对ＣＳＦＶ、ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ和 ＢＶＤＶ混合基因组分别出现与预期大小相符的片 段，而对ＰＲＲＳＶ、ＪＥＶ、ＰＲＶ、ＰＥＤＶ、ＴＧＥＶ、ＰＣＶ一２ 没有出现扩增片段（图５），说明所设计的引物可以 特异性的检测ＣＳＦＶ与ＢＶＤＶ，该双重ＰＣＲ检测方 法具有很好的特异性。 ２．４ 双重ＲＴ—ＰＣＲ敏感性试验结果 分别测定ＣＳＦＶ、ＢＶＤＶ基因组ＲＮＡ浓度，稀 释至５ ｔ￣ｇ／ｐ－Ｌ，５ ｇ／ Ｌ的ＣＳＦＶ、ＢＶＤＶ基因组 ＲＮＡ １０倍梯度稀释到１０ 混合，其反转录产物仍 然可以扩增出目的片段（图６）。说明该检测方法可 以最低检出５ ｎｇ含量的病毒基因组ＲＮＡ，该双重 ＲＴ—ＰＣＲ检测方法具有很好的敏感性。 表 一１．ＤＮＡ标准Ｔｒａｎｓ２Ｋ Ｐｌｕｓ ｌＩ；２．ＣＳＦＶ；３．ＢＶＤＶ；４．ＣＳＦＶ和 ＢＶＤＶ混合模板；５．ＰＲＲＳＶ；６．ＪＥｖ；７．ＰＲｖ；８．ＰＥＤＶ；９．ＴＧＥＶ；一一 １０．ＰＣＶ一２；１１．阴性对照 床 一 １．ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ Ｔｔａｎｓ２Ｋ ＰｌｕｓⅡ；２．ＣＳＦＶ；３．ＢＶＤＶ；４．Ｍｉｘｅｄ ｎｕｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ ｏｆ ＣＳＦＶ ａｎｄ ＢＶＤＶ；５．ＰＲＲＳＶ：６．ＪＥＶ：７． ＰＲＶ；８．ＰＥＤＶ；９．ＴＧＥＶ；１０．ＰＣＶ ２；１１．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏ１ 图５ 双重ＲＴ—ＰＣＲ特异性检测结果 Ｆｉｇ．５ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ｄｕｐｌｅｘ ＲＴ ＰＣＲ ３５５ ｌ５３ １．１０ ；２．１０ ；３．１０ ；４．对照；５．ＤＮＡ标准Ｔｒａｎｓ２Ｋ ＰｌｕｓＩＩ １．１０ ；２．１０ ；３．１０一。；４．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；５．ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ Ｔｒａｎｓ２Ｋ ＰｌｕｓⅡ 图６ 双重ＲＴ—ＰＣＲ敏感性检测结果 Ｆｉｇ．６ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ｄｕｐｌｅｘ ＲＴ—ＰＣＲ ２．５ 临床应用试验检测结果 利用建立的双重ＲＴ—ＰＣＲ检测方法检测临床 送检猪瘟疑似病料１Ｏ份，检测出ＣＳＦＶ阳性９份， 其中１份临床有腹泻症状的猪病料ＣＳＦＶ和 ＢＶＤＶ均阳性。ＣＳＦＶ国标引物和某公司ＢＶＤＶ 荧光ＰＣＲ检测试剂盒检测上述１０份样品，检测结 果为ＣＳＦＶ阳性８份，ＢＶＤＶ阳性１份（表２）。双 重ＲＴ—ＰＣＲ检测方法与猪瘟国标方法和某公司 ＢＶＤＶ荧光ＰＣＲ检测试剂盒有较高的符合率。 ２．６猪瘟细胞疫苗和原材料检测结果 利用建立的双重ＲＴ—ＰＣＲ检测方法检测１Ｏ批 猪瘟疫苗、５批牛睾丸细胞、ＳＴ细胞、ＰＫ一１５细胞、３ 个厂家的４批胎牛血清。仅一批血清ＢＶＤＶ阳性， 其余均为阴性（表３）。ＢＶＤＶ阳性血清经病原分 离，并未得到感染性ＢＶＤＶ，分析是血清来自 ＢＶＤＶ感染牛，血清生产厂家经灭菌处理，无感染 性ＢＶＤＶ存在。 № ＣＳＦＶ ＣＳＦＶ ＢＶＤＶ ＢＶＤＶ ３讨论 猪瘟是影响养猪业的主要疫病之一，虽然世界 上一些国家和地区已经消灭了猪瘟，但我国猪瘟的 持续性感染、隐性感染依然存在。牛病毒性腹泻病 毒与猪瘟病毒同属于黄病毒科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）瘟病 毒属（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ），二者之间同源性极高，存在免疫 交叉反应ｌｌ１ ，血清学方法较难区分两种病原。近年 来，猪源牛病毒性腹泻病毒感染常有发生，猪可能通 过与ＢＶＤＶ阳性牛群的直接接触或通过污染的猪 瘟疫苗而感染ＢＶＤＶ，从而给诊断工作带来了困 难ｌ＿６。］。猪感染ＢＶＤＶ后可产生类似慢性猪瘟的临 床症状和病理变化，仔猪可表现腹泻和消瘦，怀孕母 猪可致发生流产和产出畸形胎儿＿ｃ ］。ＢＶＤＶ的感 染使得猪瘟的诊断更加复杂。 双重ＲＴ—ＰＣＲ检测方法是简单、便捷的鉴别 诊断方法，通过扩增片段的大小即可对两种病毒进 ． 删 ７Ｏ 动物医学进展 ２０１４年第３５卷第４期（总第２５０期） 牛睾丸细胞１批 Ｂｏｖｉｎｅ ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ Ｎｏ １ 进口品牌（Ｇ公司）血清 Ｓｅｒｕｍ ｆｒｏｍ Ｇ ｃｏｍｐａｎｙ 牛睾丸细胞２批 Ｂｏｖｉｎｅ ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ Ｎｏ２ 国产品牌（Ｓ公司）血清 Ｓｅｒｕｍ ｆｒｏｍ Ｓ ｃｏｍｐａｎｙ 牛睾丸细胞３批 Ｂｏｖｉｎｅ ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ Ｎｏ ３ 国产品牌（Ｓ公司）猪瘟专用血清 Ｓｅｒｕｍ ｆｒｏｍ Ｓ ｃｏｍｐａｎｙ ｓｐｅｃｉａｌ ｆｏｒ ＣＳＦＶ ｖａｃｃｉｎｅ 牛睾丸细胞４批 Ｂｏｖｉｎｅ ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ Ｎｏ４ 国产品牌（Ｊ公司）猪瘟专用血清 Ｓｅｒｕｍ ｆｒｏｍ Ｊ ｃｏｍｐａｎｙ ｓｐｅｃｉａｌ ｆｏｒ ＣＳＦＶ ｖａｃｃｉｎｅ 牛睾丸细胞５批 Ｂｏｖｉｎｅ ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ Ｎｏ ５ ＳＴ细胞ＳＴ ｃｅｌｌｓ ＰＫ一１５细胞ＰＫ一１５ ｃｅｉｌｓ 行鉴别诊断。陈静等口 在研究报道中指出，他们建 立的ＣＳＦＶ和ＢＶＤＶ双重ＲＴ—ＰＣＲ方法能够对 ＣＳＦＶ和１型ＢＶＤＶ进行鉴别检测，适宜应用到猪 群感染ＢＶＤＶ的调查和疫苗生产的质控。出于相 同的目的，本研究根据ＣＳＦＶ和ＢＶＤＶ基因组５ 端 血清中会存在ＢＶＤＶ抗体。疫苗生产中，血清中的 ＢＶＤＶ抗体会中和ＣＳＦＶ，导致猪瘟抗原效价偏低。 中国牛场ＢＶＤＶ感染率较高ｌ＿１ ，所以，国产牛血 清普遍含有ＢＶＤＶ抗体。ＢＶＤＶ ＰＣＲ检测牛血清 不但可以直接判定血清是否被ＢＶＤＶ污染，也可以 间接判断血清中是否存在ＢＶＤＶ抗体。虽然 ＢＶＤＶ ＲＴ—ＰＣＲ检测牛血清不能区分血清中的 ＢＶＤＶ是否具有感染性，但是ＢＶＤＶ阳性的血清会 含有ＢＶＤＶ抗体，不适宜用于猪瘟疫苗生产。我公 的保守区分别设计了扩增ＣＳＦＶ和ＢＶＤＶ的特异 性检测引物，在普通ＲＴ—ＰＣＲ方法的基础上，将检 测ＣＳＦＶ、ＢＶＤＶ的特异性引物放在一个ＰＣＲ反应 体系中，通过优化ＰＣＲ反应条件，建立了ＣＳＦＶ和 ＢＶＤＶ双重ＲＴ—ＰＣＲ方法。研究表明，建立的双重 司使用ＢＶＤＶ ＲＴ—ＰＣＲ检测阴性的猪瘟专用血清 进行猪瘟疫苗生产，抗原效价稳定在较高水平。 综上所述，建立的ＣＳＦＶ和ＢＶＤＶ双重ＲＴ ＰＣＲ方法可以对２种疫病进行鉴别诊断，ＢＶＤＶ ＲＴ—ＰＣＲ可以对猪瘟疫苗的原料和成品进行 ＢＶＤＶ检测。 ＲＴ—ＰＣＲ方法敏感、特异。本方法的检测结果与 ＣＳＦＶ、ＢＶＤＶ国标引物检测结果的符合率分别为 ９０ 和１００ 。 范学政等ｌ＿１ 报道的猪瘟细胞苗ＢＶＤＶ的污染率为 ２１．７４ ，说明我国猪瘟疫苗中ＢＶＤＶ污染现象严 重。本研究所建立的ＣＳＦＶ、ＢＶＤＶ双重ＲＴ—ＰＣＲ 参考文献： ［１］Ｌｅｉｆｅｒ Ｉ，Ｒｕｇｇｌｉ Ｎ，Ｂｌｏｍｅ Ｓ．Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｄｅｆｉｎｅ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｇｅ 检测方法可以检测猪瘟疫苗是否被ＢＶＤＶ污染。 当然，单独使用ＢＶＤＶ引物检测猪瘟疫苗是更为简 便的ＢＶＤＶ检测方法。研究建立的方法还可以对 ｎｅｔｉｃ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２Ｏ１３，４３８（２）：５卜５５． 细胞、血清等疫苗生产用原材料进行质控。检测到 ＢＤＶＤ污染的细胞和毒种严禁应用于疫苗生产。 检测到ＢＶＤＶ污染的疫苗严禁投放市场。但是血 清的情况比较复杂，应具体问题具体对待。 一［２］张艳英，高桂生，高光平，等．猪瘟病毒３种检测方法的比较 ［Ｊ］．中国畜牧兽医，２０１３，４０（３）：２０５—２０８． ［３］Ｈｅｌａｌ Ｍ Ａ，Ｏｋａｍａｔｓｕ Ｈ，Ｔａｊｉｍａ Ｍ．Ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｄａｉｒｙ ｈｅｒｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｌｙ ｉｎ ｆｅｃｔｅｄ ｃａｌｖｅｓ［Ｊ］．Ｊｐｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ，２０１２，６０（２－３）：１１１—１１７． ［４］Ｂｅｄｅｋｏｖｉｃ Ｔ，Ｍｉｈａｌｊｅｖｉｃ ｚ，Ｊｕｎｇｉｃ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ— ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｆｒｅｓｈ ｃｏ—－ 般来说，猪瘟疫苗的生产过程中需使用胎牛 血清或小牛血清作为细胞培养液成分，而牛血清被 ＢＶＤＶ污染，将导致猪瘟疫苗污染ＢＶＤＶ［９ 。血 清生产厂家普遍采用辐照灭菌杀死病原微生物，即 使血清来自ＢＶＤＶ感染牛，多数情况下有感染性的 ｌｏｓｔｒｕｍ：ａ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ［Ｊ］．Ｊ Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１３，２５（２）：２６３—２６６． ［５］孙泉云，陈琦，夏炉明，等．猪感染牛病毒性腹泻病毒的研究 进展［Ｊ］．国外畜牧学：猪与禽，２ｏ１１（５）：８９—９０． ［６］邓宇．猪源牛病毒性腹泻病毒研究进展ｒＩ］．畜牧与兽医， ＢＶＤＶ在血清中也并不存在，但是感染ＢＶＤＶ的牛 李晶梅等：猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重ＲＴ—ＰＣＲ鉴别检测方法的建立及应用 ７１ ２Ｏ１２，４４（９）：９７—９９． ６ｌ５—６２０． Ｅ７３邓宇。孙春清，张宏彪，等．１株猪源牛病毒性腹泻病毒的分 ［１３］陈静，张小飞，范红结，等．猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒 离与鉴定［Ｊ］．畜牧兽医学报，２０１２，４３（３）：４１６－４２３． 双重ＲＴ－ＰＣＲ方法的建立和初步应用［Ｊ］．中国畜牧兽医， ［８］仇华吉，童光志，沈荣显．猪瘟兔化弱毒疫苗——半个世纪的 ２０１１，３８（６）：９４－９７． 回顾［Ｊ］．中国农业科学。２００５，３８（８）：１６７５—１６８５． ［１４］范学政，宁宜宝，王 琴，等．用ＲＴ—ＰＣＲ方法检测猪瘟细胞 ［９］毛晓娜，缪芬芳，季 伟．牛病毒性腹泻病毒在猪瘟疫苗中的 苗中污染牛病毒性腹泻病毒［Ｊ］．中国兽医杂志，２Ｏ１Ｏ，４６（１）： 污染情况及其检测方法的研究进展［Ｊ］．中国畜牧兽医，２０１３， ８—１１． ４０（２）：１７５—１７８． 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ｈａｖｅ ｈｉｇｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｔｗｏ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｗａｓ ｖｅｒｙ ｓｅｒｉｏｕｓ，ｗｈｉｃｈ ｍａｄｅ ａ ｇｒｅａｔ ｄｅａｌ ｏｆ ｔｒｏｕｂｌｅ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，ｔｗｏ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｎ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｇｅｎｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｔｒａｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ ｇｅ— ｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ．Ａｆｔｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ａ ｄｕｐｌｅｘ ＲＴ—ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｗｏ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ。Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＰＲＲＳＶ，Ｊ ＥＶ，ＰＲＶ，ＰＥＤＶ，ＴＧＥＶ，ＰＣＶ＿２ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ：ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ５ ｎｇ．Ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＲＴ－ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｈａｓ ｇｏｏｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｉｔ ｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｖｉｒｕｓ，ａｎｄ ａｌｓｏ ｃａｎ ｈｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｉｔ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｃｏｎ— ｖｅｎｉｅｎｔ ａｎｄ ｆａｓｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｗｏ ｖｉｒｕｓ ｃｒｏｓｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ；Ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ；ｄｕｐｌｅｘ ＲＴ—ＰＣＲ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
