第３Ｏ卷第６期 ２＂Ｏ１１年１１月 食品与生物技术学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉ０ｔｅｃｈｎ０ｌｏｇｙ Ｖｏｌ｜３０ ＮＯ．６ ＮＯＶ． ２０１１ 文章编号：１６７３—１６８９（２０１１）０６—０９４０—０５ 海栖热袍菌 一葡萄糖苷酶基因ａｇｌＡ的 克隆、表达及酶学性质 王月宏 ， 段作营 ， 邵 蔚蓝 ， 李华钟“ （１．江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡２１４２２２；２．南京师范大学生命科学学 院，江苏南京２１００９７） 摘 要：主要研究了在大肠杆菌中克隆和表达海栖热袍菌（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）的一个ａ一葡萄 糖苷酶（ＴＭ１８３４）。通过ＰＣＲ方法克隆编码Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ的一个ａ一葡萄糖苷酶基因ａｇｌＡ，构建 重组质粒ｐＨｓｈ—ＡｇｌＡ，电击转化Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９，通过热激诱导高效表达。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ检 测出蛋白相对分子质量约５５ ０００，经热处理，阴离子交换层析和疏水层析纯化后的１２．一葡萄糖苷酶 最适反应温度为９Ｏ℃，最适反应ｐＨ为７．５，在ｐＨ ６．５～８．５，温度６５～１０Ｏ℃之间酶活仍达到 ５Ｏ 以上。在辅助因子ＮＡＤ ，Ｍｎ抖和还原剂ＤＴＴ的存在条件下达到最高酶活。 关键词：ａ一葡萄糖苷酶；海栖热袍菌；ＮＡＤ。。；酶学性质 中图分类号：Ｑ ７８ 文献标识码：Ａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ａ。Ｇｉｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ，Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＷＡＮＧ Ｙｕｅ—Ｈｏｎｇ ，ＤＵＡＮ Ｚｕｏ—ｙｉｎｇ ， ＳＨＡＯ Ｗｅｉ—Ｉ ａｎ ，ＬＩ Ｈｕａ—Ｚｈｏｎｇ （１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｓａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４０３６，Ｃｈ ｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００４６，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ａ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ ａｇｌＡ（ＴＭ１８３４）ｆｒｏｍ ａ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ，ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｗ ｈｅａｔ—ｓｈｏｃｋ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＨｓｈ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ａｇｌＡ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｈｅａｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ａｎｄ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ａｎｄ ｈａｄ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ５５ ｋＤａ ａｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｂｙ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐＨ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｉｓ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ＰＨ ７．５ ａｎｄ ９Ｏ℃，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ５０ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｔ ｐＨ ｖａｌｕｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ６．５ ａｎｄ ８．５ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ６ ５℃ａｎｄ １ ００℃．Ｔｈｅ ｍａｘｉｍａｌ ａｇｌＡ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏｆａｃｔｏｒ ＮＡＤ ，Ｍｎ ，ａｎｄ ＤＴＴ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｄ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ，ＮＡＤ ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ 收稿日期：２Ｏ１Ｏ一】１—０１ 基金项目：江苏省自然科学基金项目（ＢＫ２００６２２０）。 作者简介：王月宏（１９８３ ），女，江苏仪征人，发酵工程博士研究生，主要从事工业微生物及生物制药研究。 Ｅｍａｉｌ：ｗｙｈｒｅｄｍｏｏｎ＠ｌ２６．ｃｏｒｎ ＊通信作者：李华钟（１９５８一），男，山东龙口人，教授，博士研究生导师，主要从事工业微生物及生物制药研究。 Ｅｍａｉｌ：ｈｚｈｌｉ＠ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ 第６期 王月宏等：海栖热袍菌ａ一葡萄糖苷酶基因ａｇｌＡ的克隆、表达及酶学性质 ９４１ ５－葡萄糖苷酶（ａ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．２０） 又叫ａ—Ｉ）－葡萄糖苷水解酶，它可以从低聚糖类底物 的非还原末端切开５－１，４糖苷键，释放出葡萄糖， 或将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形 成ａ一１，６糖苷键，从而得到非发酵性的低聚异麦芽 糖或糖酯、糖肽等［１ ］。 一葡萄糖苷酶广泛分布，几 乎存在于所有生物体内，在人类的糖原降解和动 物，植物以及微生物的糖代谢中具有重要的生理功 能 一 。 目前越来越多的来源于极端嗜热微生物的ａ一 葡萄糖苷酶受到了研究和重视，如Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕ－ ｒｉｏｓｕｓ（１０５～１１５℃），Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌ ｔａｒｉｃｕｓ （１０５℃），Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（８５℃）［９－１１］。 海栖热袍菌（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）是生长在 ５５～９０℃海底火山口的极端嗜热严格厌氧杆状微 生物，最适生长温度８０℃，培养条件极其苛刻，并 且细胞产量较低［】 卜¨］。１９９９年海栖热袍菌全基因 组序列已经测通并公布。该菌的开放阅读框 ＴＭ １８３４，ＴＭ ０４３４，ＴＭ １０６８，ＴＭ ０７５２均编码 ａ一葡萄糖苷酶。作者主要报道了ＴＭ一１８３４基因的 克隆，首次利用Ｈｓｈ热激表达系统在大肠杆菌中表 达，并对重组酶进行了分离纯化和酶学性质研究， 为该重组酶的后续研究奠定了基础。 １材料与方法 １．１主要试剂及仪器 性内切酶、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、ＤＮＡ相对分 子质量标准、蛋白质相对分子质量标准和Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ聚合酶购自宝生物工程公司（ＴａＫａＲａ）；酵母 提取物和胰蛋白胨：购自ＯＸＯＩＤ公司；氨苄青霉素 （Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）：购自上海生工生物工程技术服务有 限公司；质粒抽提试剂盒和胶回收试剂盒：购自 Ｑｉａｇｅｎ公司；引物：上海生工生物技术公司合成；其 它生化试剂：购于Ｓｉｇｍａ等公司。 １．２菌株和质粒 丁．ｍａｒｉｔｉｍａ ＭＳＢ８、大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ＣＯ— ｌｉ）ＪＭｌＯ９、表达质粒ｐＨｓｈ（中国专利， ２００４１００４１６３６．７）由作者所在研究室保藏，Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９购于Ｐｒｏｍｅｇａ公司。 １．３培养基和培养条件 Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ ＭＳＢ８培养基采用改良的ＬＢ培 养基，培养方法参照参考文献Ｌ１引，大肠杆菌重组子 培养采用含１００￣ｇ／ｍＬ Ａｍｐ的ＬＢ培养基（蛋白胨 １０ ｇ／Ｌ，酵母提取物５ ｇ／Ｌ，氯化钠１０ ｇ／Ｌ，ｐＨ ７．０） １．４引物设计 按照已公布海栖热袍菌ａ一葡萄糖苷酶基因序 列 设计引物，委托中科院上海生物工程中心合成。 引物１：５ 一ＣＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＡＧＡＴＣ－３ ； 引物２：５ ｒ＿ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＴＣＡＧＡＴ ＡＡＴＧＴＴ一３ ，引入Ｘ ０ Ｉ位点。 １．５重组质粒ｐＨｓｈ－ＡｇｌＡ的构建 以提取的Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ ＭＳＢ８的基因组ＤＮＡ 为模板，用高保真性聚合酶Ｐｙｒｏｂｅｓｔ酶对模板进行 扩增（９４℃，３０ Ｓ；４６℃，８０ Ｓ；７２℃，１．５ ｍｉｎ），３０个 循环后电泳检查。ＰＣＲ扩增产物回收参考Ｑｉａｎ－ ｇｅｎ ＰＣＲ产物纯化试剂盒操作手册。得到 Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ ＭＳＢ８ ａ一葡萄糖苷酶基因ａｇｌＡ。用 Ｘｈｏ Ｉ酶切并纯化得到的ａ一葡萄糖苷酶基因片段， 以适当比例与已经Ｓｔｕ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ酶切并纯化的 ｐＨｓｈ载体混合，加入连接酶，１６℃过夜，转化Ｅ ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９构建含Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ ＭＳＢ８葡萄糖异 构酶基因ａｇｌＡ的重组质粒ｐＨｓｈ—ＡｇＺＡ。 １．６Ⅱ一葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的诱导表达 将重组菌接种到５ ｍＬ氨苄ＬＢ培养基，在３７ ℃摇床中进行振荡培养至对数期，以２ 接种量于 ５０ ｍＬ氨苄ＬＢ培养基中，先置于３０℃摇床，２００ ｒ／ ｍｉｎ进行振荡培养至Ａ。 为０．８时，再迅速移至 ４２℃水浴摇床中继续进行振荡培养热激表达，继续 培养６～８ ｈ后，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心收集菌体，用５０ ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲液（ｐＨ ７．０）洗涤菌体２ 次，再用２．５ ｍＬ同样缓冲液重悬菌体，超声波破碎 细胞后１２ ０００ ｒ／ｒａｉｎ离心，取上清即为重组ａ一葡萄 糖苷酶粗酶液。 １．７重组ａ一葡萄糖苷酶酶活的测定 将酶液用对硝基酚ａ—Ｉ）＿葡萄糖苷（ｐＮＰＧ）为底 物测定酶活，总酶活反应体系２００ ＦＬ，其中１０肚Ｌ ｐＮＰＧ（浓度为０．１ ｔｏｏｌ／Ｌ），２０ ＦＬ ＭｎＣ１ （浓度为 １０ ｍｍｏｌ／Ｌ），２０ Ｌ ＮＡＤ （浓度为９ ｍｍｏｌ／Ｌ），１０ ｆＬ ＤＴＴ（浓度为１ ｍｏｌ／Ｌ），２０ ｆｆＬ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲液 （浓度为０．５ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７）于８Ｏ℃水浴中保温５ ｍｉｎ，加入１Ｏ Ｌ酶液，反应１０ ｍｉｎ，取出放在冰上 终止反应，立即加入６００ ｍＬ １ ｍｏｌ／Ｌ碳酸钠溶液 显色，于４１０ ｎｍ测定吸光度。在上述条件下，每分 钟水解生成１／ｚｍｏｌ对硝基酚所需的酶量为一个酶 活力单位。 １．８重组 葡萄糖苷酶的纯化及保存 高温热处理：将粗酶液置于８０℃水浴锅中热处 理１０ ｒａｉｎ，随后置于冰上冷却５ ｒａｉｎ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心３０ ｍｉｎ去除大热变性杂蛋白。 ９４２ 食 品 与 生 物技 术 学 报 第３０卷 阴离子交换层析：将热处理酶液经过０．４５ ｍ 微孔滤膜过滤后上样于ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，由含有１００～４００ ｍｍｏｌ／Ｉ ＮａＣ１的样品缓冲 液以１．５ ｍＩ ／ｍｉｎ的速度进行线性洗脱，收集到活 力峰后，用质量分数５０ 的硫酸铵沉淀。 疏水柱层析：输水柱经过Ｔｒｉｓ—ＨＣＩ缓冲液（浓 度为０．５ ｍｏｌ／Ｉ ，ｐＨ ７，质量分数５Ｏ 硫酸铵）平衡 后，将上述酶液上柱后，先用含有质量分数５０ 硫 酸铵上样缓冲液洗脱未结合蛋白，然后以质量分数 ５０ ～０ 硫酸铵洗脱，收集活力峰。 纯酶的保存：用２Ｏ ｍｍｏｌ／Ｉ 磷酸缓冲液（ｐＨ ６．５，体积分数２０ 甘油，４℃）透析过夜后，加入适 量ＤＴＴ、ＭｎＣ１２和ＮＡＤ 后一２Ｏ℃保存。 ２ 结 果 ２．１ 葡萄糖苷酶基因的克隆、鉴定及表达载体的 构建 采用ＰＣＲ技术成功的从Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ ＭＳＢ８ 基因组中扩增得到ａ一葡萄糖苷酶基因ａｇｌＡ（１ ４４３ ｂｐ），见图１。ＰＣＲ产物经过Ｘ ０ Ｉ酶切后，与经过 Ｓｔｕ Ｉ和Ｘｈｏ Ｉ双酶切的ｐＨｓｈ质粒以适当比例混 合连接，得到含有ａ一葡萄糖苷酶基因ａｇｌＡ的表达 载体ｐＨｓｈ—ＡｇｌＡ，转化受体菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭｌＯ９。在 ＡＭＰ平板中挑选转化子，进行菌落ＰＣＲ验证。采 用ａ一葡萄糖苷酶结构基因的上下游引物扩增出大 约１．５ ｋｂ的特异性片段（图２）。 ２ １ ２０００ １ ０００ ７５０ ５００ ２５０ １ＯＯ １：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；２：ａ葡萄糖苷酶基 图１海栖热袍菌骨葡萄糖苷酶基因的ＰＣＲ产物电泳图 Ｆｉｇ．１ ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ ｉｎ ｍａｒｉｔｉｍｅ ２．２ ０‘－葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶 的纯化 将重组菌株接种于含氨苄青霉素的ＬＢ培养 基，经６～８ ｈ热激诱导后，离心收集菌体，超声波破 碎，离心获得上清可溶性粗酶液，将粗酶液经过８Ｏ ℃水浴锅热处理１０ ｍｉｎ，再经过离子交换层析和疏 水层析后可以得到电泳纯的酶样品（列４），见图３。 ２ ＯＯｆｆ １ ０００ ７５０ ５００ ２００ ｌ：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；２：菌落ＰＣＲ特异性片段 图２重组质粒酶切验证图 Ｆｉｇ．２ Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｌｏｎｙ ＰＣＲ ９７４００ ６６ ２００ Ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ，１：Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９重组菌粗酶液，２：热处理 后卜清液，３：经过阴离子柱纯化后的蛋白，４：经过疏水柱纯化 后的蛋白 图３重组蛋白纯化过程ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图 Ｆｉｇ．３ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ ｓｔｒａｉｎ ２．３重组葡萄糖异构酶的酶学性质 ２．３．１ ＮＡＤ 浓度对酶活的影响 反应体系中含 有１ ｍｍｏｌ／Ｉ ＭｎＣ１２和５０ ｍｍｏｌ／Ｉ 的ＤＴＴ，加入不 同浓度的ＮＡＤ ，计算其相对酶活。结果如图４， ＮＡＤ 浓度为０．９ ｍｍｏｌ／ｌ 时酶活最高。 ２．３．２ 金属离子和还原剂ＤＴＴ对酶活的影响 在标准酶反应体系中，用５ ｍｍｏｌ／Ｉ 各种不同金属 离子代替原有体系中的金属离子，测得经过ＥＤＴＡ 处理过的酶液的酶活力。结果表明，纯化后的 ＡｇｌＡ，在没有添加Ｍｎ。 情况下无法检测到酶活。 Ｃａ ，Ｍｇ 或者Ｚｎ。 的加入只能检测到微量酶活， 当Ｍｎ 浓度１ ｍｍｏｌ／Ｉ 时酶活达到最高。当还原 剂ＤＴＴ的浓度高于５０ ｍｍｏｌ／Ｉ 时，重组酶的酶活 仍然在提高。 ２．３．３ 最适反应ｐＨ在不同的ｐＨ条件下分别测 定酶活。结果如图５，该重组酶最适反应ｐＨ ７～ ７．５ 第６期 王月宏等：海栖热袍菌ａ一葡萄糖苷酶基因ａｇｌＡ的克隆、表达及酶学性质 ９４３ １ＯＯ ８Ｏ 烬６Ｏ 蜒 溢 ｛茜 蒌４ｏ 靛 ２Ｏ ０ ０ ０．２ ０．４ ０．６ ０．８ １ １．２ １．４ １．６ １．８ ９Ｏ ｌＯＯ ＮＡＤ 浓度／（ｍｍｏｌ／Ｌ） 温度ＦＣ 图６重组酶的最适反应温度 图４ ＮＡＤ 浓度对酶活的影响 Ｆｉｇ．６ Ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ＡｇｌＡ Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＮＡＤ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＡｇｌＡ ａｃｔｉｖｉｔｙ ３ 结 语 １Ｏ０ 采用新型的热激表达质粒ｐＨｓｈ成功表达了来 ８０ 源于海栖热袍菌的ａ一葡萄糖苷酶。ｐＨｓｈ含有能被 薹６０ 大肠杆菌中的。 识别的启动子，作为表达载体的优 势在于避免使用了常规的诱导底物ＩＰＴＧ，在一定 镟 簦４０ 程度上减少了成本。 表达的特异蛋白相对分子质量约为５５ ０００，经 ２Ｏ 过纯化后的ａ一葡萄糖苷酶无法检测到酶活，在强还 原性体系中，加入辅助因子ＮＡＤ 以及Ｍｎ 后才 Ｏ 能检测完全检测到酶活，没有发现其他的金属离子 ５．５ ６ ６．５ ７ ７．５ ８ ８．５ ９ ｐＨ值 对该酶有较强的激活作用。目前还没有其他来源 图５重组酶的最适反应ｐＨ 的ａ一葡萄糖苷酶具有此类的特征。该重组酶最适 Ｆｉｇ．５ Ｏｐｔｉｍｕｍ ｐＨ ｏｆ ｔｈｅ ＡｇｌＡ 反应温度９０℃，最适反应ｐＨ为７．５。该酶能作用 ２．３．４ 最适反应温度 在不同温度下测定酶活， 于ｐＮＰＧ，可水解含有ａ－１，１，ａ一１，２，ａ一１，４和ｏ【一１，６ 以最高酶活为１００ ，结果见图６，该重组酶最适温 的短碳链（≤５）糖类底物，不能水解长链大分子如 度为９Ｏ℃。并在７５℃和１００℃之间仍有８Ｏ ９／６的 淀粉。同大部分的ａ一葡萄糖苷酶一样，该酶水解底 活性。 物的速度随着底物链长的增加而降低。 ２．３．５酶的底物专一性在标准反应条件下，用１ 实验中的表达产物是胞内酶，增加了后续的分 ｇ／ｄＩ 的不同底物与酶进行反应。该酶能水解 离纯化的步骤和成本，因此在下一步实验中，作者 ｐＮＰＧ，ｐＮＰ—ａ—Ｄ－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ，麦芽糖，异麦芽糖，麦 将在分泌型表达载体毕赤酵母中表达胞外酶，以期 芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖，蔗糖，海藻糖，但是不 望得到更高的表达水平，为后续酶分子的结构研究 能水解可溶性淀粉。 以及酶的应用奠定基础。 参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）： ［１］胡学智，凌晨，武雯，等．葡萄糖苷转移酶生产菌种的筛选Ｉ－Ｊ］．工业微生物，１９９８，２８（１）：１—６． ＨＵ Ｘｕｅ－ｚｈｉ，ＬＩＮＧ Ｃｈｅｎ，ｗＵ ｗｅｎ，ｅｔ ａ１．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｇ１ｕｃ０ｓｉｄａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎｓｉ，Ｊ－］．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，２８（１）：１—６．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［２］Ａｋｉｋｉｋｏ Ｋ，Ｈｉｒｏｋａｊｕ Ｍ，Ａｋｉｓｋｉｇｅ Ｓ ｅｔ ａ１．Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｕｂｓｉｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｏｆ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ａ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｓ— ｐｅｒｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒｉ，Ｊ］．Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９１，５５（９）：２３２７—２３３５． ［３］Ｔａｋｅｗａｋｉ Ｓ，Ｋｉｍｕｒａ Ａ，Ｋｕｂｏｔｒａ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｏｆ ｈｏｎｅｙｂｅｅ ａ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅⅡＩ－Ｊ］． ９４４ 食品 与 生 物 技 术 学 报 第３Ｏ卷 Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｃｈ，１９９３，５７（９）：ｌ５０８—１５１３． ［４］岳振锋，陈小霞，彭志英．ａ一葡萄糖转苷酶研究现状及进展ＥＪ］．食品与发酵丁业，２０００，２６（３）：６３—６７． ＹＵＥ Ｚｈｅｎ—ｆｅｎｇ，ＣＨＥＮ Ｘｉａｏ—ｘｉａ，ＰＥＮＧ Ｚｈｉ ｙｉｎｇ．Ｓｔａｔｕｓ ｑｕｏ ａｎｄ ａｄｖａｎｃｅ ｏｆ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ａ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｆｅｒ— ｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，２０００，２６（３）：６３—６７．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［５］Ｃｈｉｂａ Ｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ ａｌｐｈａ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ａｎｄ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅｌ，Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９７，６１（８）：１ ２３３ １２３９． ［６］Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｉ，Ｔｏｋｕｄａ Ｍ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｏｆ ｉｆ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｌｉｌａｃｉｎｕｓ ｔｈａｔ ｈａｓ ｔｒａｎｓｇｌｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔＯ ｐｒｏｄｕｃｅ ａ １，３～ａｎｄ —ｌ，２－ｌｉｎｋｅｄ ｏ¨ｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００３，６７：２９—３５． ［７］Ｈｕｎｇ ＶＳ，Ｈａｔａｄａ Ｙ，Ｇｏｄａ Ｓ，ｅｔ ａ１．ｄ—Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｄｅｅｐ—ｓｅａ Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ：ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｉｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５，６８（６）：７５７—７６５． ［８］毕金峰，魏宝东，李长彪．黑曲霉产 一转移葡萄糖苷酶固态发酵条件优化［Ｊ］．食品与生物技术学报，２００５，２４（２）：６５ ６８． ＢＩ Ｊｉｎ ｆｅｎｇ，ＷＥＩ Ｂａｏ—ｄｏｎｇ，ＬＩ Ｃｈａｎｇ—ｂｉａｏ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｓｏｌｉｄ—ｓｔａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａ ｔｒａｎｓｇｌｕｃｏｓｉ ｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐ．Ｎｉｇｅｒｌ，Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，２４（２）：６５—６８．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［９］Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ ＨＲ，Ｂｒｏｗｎ ＳＨ，Ｋｅｌｌｙ ＲＭ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｌｐｈａ ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ，ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ ａ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｏｆ １０５ ｔＯ １ １５ ｄｅｇｒｅｅｓ ｃＥＪ］．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，ｌ【ｊ９０， １７２：３６５４—３６６０． ［１Ｏ］Ｍａｒｔｉｎｏ Ａ，Ｓｃｈｉｒａｌｄｉ Ｃ，Ｆｕｓｃｏ Ｓ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃ｛－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔＯ ｓｔａｒｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２００１，１１：７８７—７９４． ［１１］刘军，周成，马延和等．嗜热栖热菌ａ一葡萄糖苷酶基因的表达及酶学性质研究［Ｊ］．微生物学通报，２００７，３４（２）：２３２ ２３５． Ｉ ＩＵ Ｊｕｎ，ＺＨＯＵ Ｃｈｅｎｇ，ＭＡ Ｙａｎ—ｈｅ。ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ａ－（；ｌｕｃｏ ｓｉｄａｓｅ ｇｅｎｅｌ，Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，３４（２）：２３２—２３５．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１２］Ｗｉｅｇｅｌ Ｊ，Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ ＬＧ．Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ ｇｅｎ．ｎｏｖ．，ｓｐｅｃ．ｎｏｖ．，ａ ｎｅｗ，ｅｘｔｒｅｍｅ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ，ａｎａｅｒｏ ｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ［Ｊ］．Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８ｌ，１２８（４）：３４３—３４８． ［１３１ ＪＩＡＮＧ Ｙｕ，ＺＨＯＵ Ｑｉｎ，Ｓｈａｏ Ｗｅｉ—ｌａｎ．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｌｉｑｕｉｄ ａｎｄ ｓｏｌｉｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｈｙｐｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ Ｉ－Ｊ］．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ，２００６，２５９：２５４—２５９．
