承 德 医 学 院 学 报 ＶＯ１．２８ Ｎｏ．４ ２０１１ ＨＰＬＣ法测定橄榄苦苷含量时内标物及色谱条件的研究 尹营松，陈四平，赵桂琴 （承德医学院中药研究所，河北承德０６７０００） 【摘要】目的：确定ＨＰＬＣ法测定橄榄苦苷含量时所需的内标物及较优色谱条件。方法：用紫外分光光度计对 橄榄苦苷、黄芩苷、没食子酸、绿原酸等标准物质进行全波长扫描确定检测波长，采用正交实验方法设计实 验，在不同色谱条件下，测定各标准物质的保留时间、峰宽，计算分离度，根据分离度及保留时间，确定最优色 谱条件及内标物。结栗：正交实验结果，色谱柱不同水平间的Ｆ＝３９．５０，流动相不同水平问的Ｆ＝４８．１９，均＞ Ｆｎ。 （２，２）＝１９（Ｐ＜０．０５），差异具有统计学意义，不同标准品间比较差异无统计学意义。结论：在本正交设计中， 橄榄苦苷最优色谱条件为色谱柱：Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８（４．６×１５０ｒａｍ，５ ｍ），流动相：水一甲 醇一甲酸为６ｏ：４０：ｌ，内标物为黄芩苷。 【关键词】正交设计；橄榄苦苷；内标物；高效液相色谱 【中图分类号】Ｒ＿９ｌ７ 【文献标识码】Ａ ＳＴＵＤＹ ＯＮ Ｄｎ ＲＮＡＬ 【文章编号】ｌ００４＿６８７９（２０ｌ １）０４－０３６２－０２ ＤＡＲＤ ＡＮＤ ＣＨＲｏＭ ｒ０ＧＲＡＰｍＣ ＣＯＮＤＩ１ｒＩｏＮ ＩＮ ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮ ＯＦ ＯＬＥＵＲｏＰＥ ＣｏＮＴＥＮＴ ＢＹ Ｈ ＬＣ ＹＩＮＹｍｇ－ｓｏｎｇ，ＣＨＥＮＳｉ－ｐｉｎｇ， ｛Ａ０Ｇｕｉ－ｑｉｎ （ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｉａＭｅｄｉｃａ，ＣｈｅｎｇｄｅＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｈｅｂｅｉ Ｃｈｅｎｇｄｅ ０６７０００，Ｃｈｉｎａ） 【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｉｎｔｅｍａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ ｃｏｎｔｎｔｂｙ ｅＨＰＬＣ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｌｕｌｒａｖｉｏｌｅｔ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒｗａｓ ｕｓｅｄｔｏ ｓｃａｎ ｏｌｅｍ＇ｏｐｅｉｎ，ｂａｉｃａｌｉｎ，ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ， ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｗｉｈ ｔｆｕｌｌ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｎｇｔｅｈ．Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔＷａｓ ａｐｐｌｉｅｄｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｃｏｎｄｉｉｔｏｎ ｎｄ ａｉｎｔｅｍａｌ ｓｔａｎｄａｒｄｂｙ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ，ｐｅａｋ ｗｉｄｔｈ ｎｄ ａｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｆ＝３９．５０ ｏｆｃｏｌｕｍｎ ａｔ ｉｆｄｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ，Ｆ＝４８．１９ ｏｆｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｔ ａｄｉｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ，ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ａｌｌ＞ Ｆ００５（２，２）：＝ｌ９（ ０．０５）．Ｔｈｅｒｅ ｈａｄ ｎＯ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｉｄｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｉｎ ｔｈｉｓ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ，ｔｈｅｂｅｓｔｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｏｎｄｉｃｉｔｏｎｏｆｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ：ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｏｌｃｕｍｎｉｓＡｇｉｌｎｔＺＯＲＢＡＸＥｃｌｅｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８（４．６ １５０ｍｍ，５ｇｍ），ｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｉｓｗａｔｅｒ－ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｆｏｒｍｉｃａｃｉｄ（６０：４０：１），ｉｎｔｅｒｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｉｓｂａｉｃａｌｉｎ． 【ＫＥＹ、７ｌ ＩＲＤＳ】Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎ；Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ；Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ；ＨＰＬＣ 橄榄苦苷是从素馨花７０％乙醇提取物中分离得到的 环烯醚萜苷类化合物，其体内９ｂ￣ＨＢＶ活性明确，在素 馨花药材中含量丰富（初步估算超过５％），易于分离纯化， 纯度＞９８％；黄芩苷，中国药品生物制品检定所，批 号：１１０７１５－２０１０１６；绿原酸，中国药品生物制品检定 所，批号：ｌ１０７５３－２００４１３；没食子酸，中国药品生物制 有望成为新型抗ＨＢＶ活性先导化合ｆｌ勿【“。但目前尚缺乏 动物体内药代动力学资料支持。目前，国内已有ＨＰＬＣ法 测定橄榄苦苷含量的相关报道，但测定方法中均未加入 品检定所，批号：ｌ１０８３卜２００８０３。乙腈、甲醇，色谱纯， Ｄｉｋｍａｐｕｒｅ；甲醇、甲酸，分析纯。 １．２仪器及色谱条件ＡｇｉｌｎｔＨＰＬＣ一１ｅ２００型高效液相 内标等勿ｌ 。本研究通过正交设计，对不同色谱条件进行 优化筛选，确定橄榄苦苷测定的最优条件及内标物，为进 一色谱仪，美捷司；ＡｇｉｌｅｎｔＺＯＲＢＡＸＥｃｌｉｐｓｅＸＤＢ－ Ｃｌ８（４．６ｘ １５０ｒａｍ，５ ｍ）色谱柱，ＡｇｉｌｎｔＺＯＲＢＡＸ ｅｓＢ １８ （４．６×２５０ｒａｍ，５ ｍ）色谱柱，ＤｉａｍｏｎｓｉｌＣ１８（４．６ｘ２５０ａｒｍ， 步准确测定动物体内药代动力学参数提供依据。 １材料与方法 １．１ 药品与试剂 橄榄苦苷，实验室自制，经鉴定 ５¨ｍ）色谱柱。流动相：水＿乙腈（７９．５：２０．５），水一甲醇一 甲酸（５０：５０：１），水＿甲醇＿甲酸（６０：４０：１）；流速：ｌｍｌ／ｍｉｎ。 １．３对照品溶液的制备分别精密称取橄榄苦苷 ０．７ｍｇ、黄芩苷０．９ｍｇ、没食子酸１．５ｍｇ、绿原酸１．３ｍｇ，置 △通讯作者 ・３６２・ 承 德 医 学 院 学 报 ＶＯ１．２８ Ｎｏ．４ ２０１ １ １０ｍｌ容量瓶中，甲醇超声溶解，定容，得到浓度为橄榄苦 苷０．０７ｉｉ￣／ｍｌ、黄芩苷０． ｍｌ、大黄素０．１５ｒａｇ／ｍ１、绿 表３正交设计实验方差分析表 原酸０．１３ｍｇ／ｍｌ的标准品溶液。 １．４测定波长的确定采用紫外可见分光光度计对上述 标准品溶液在２０ｏ＿４００ｎｍ波长进行全波长扫描，各个标准 物质￣Ｌ２７６ｎｍ处均有较强吸收，确￣＿２７６ｎｍ为检测波长。 １．５正交实验设计以色谱柱、溶剂系统、标准物质为 由方差分析表可见，色谱柱不同水平间￣Ｆ＝－３９．５０，流 动相不同水平间￣ｐ－－４８．－１９，均＞Ｆ０．∞（２，２ ｌ９ ＜０．０５）， 不同因素，色谱柱以Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｌ￣ＸＤＢ－Ｃｌ８ （４．６Ｘ １５０ａｒｍ，５ ｍ）色谱柱、Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＩ强ＡＸ ＳＢ—Ｃｌ８ （４．６ｘ２５０ｍｍ，５ ｍ）色谱柱、Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃｌ８（４．６Ｘ２５￣ｘｎ， ５ ＩＩ１）色谱柱为不同水平，溶剂系统以水一乙腈（７９．５： ２０．５）、水一甲醇一甲酸（５０：５０：１）、水一甲醇一甲酸（６０：４０：１） 为不同水平，标准物质以绿原酸、没食子酸、黄芩苷为不 同水平设计正交实验，见表１。 表１正交实验设计的因素及水平 ｚ结果 根据正交实验设计，在２７６ｎｍ处测定，记录各标准 物质在不同色谱条件下的保留时间、峰宽，计算各标准 物质与橄榄苦苷在不同色谱条件下的分离度，实验结果 见表２，方差分析结果见表３。 耋 垩窒 壅鳖墨 试验号 Ａ Ｂ Ｃ 分离度 标准物质 保留时间（ｍｉｎ） ｔ ∞．６ ｚ ｔ ｚ ｚ ｚ ． 蓑馨莩墓 ．． １ ３： ， ｓ ； ｚ ｚ ｓ・． 蓑警季 １ ８．． ５ ０ ４ ｓ ｚ ｚ ， ． 鬻 ｚ ｓ ７５．５ｓ ｓ ｚ －，ｏ ｚ ｓ 墓 Ｋ． １０５．３８６ ｌ９６．５９ｌ ｌ５５．７６ｌ Ｋ， ７４．６７２ ｌ００．８０２ １１８．５０６ Ｋ １８９．００６ ７１．６７ｌ ９４．７９７ Ｒ ３８．１ｌｌ ４１．６４ ２０．３２ｌ 差异具有统计学意义，不同标准品间无明显差异。 ３讨论 据文献报道，橄榄苦苷最大吸收波长为２３２ｎｍ，在 ２８Ｏｈｍ处也有较大吸收，本研究选择标准物质的最大吸 收波长均￣２３２ｎｒｎ与２８Ｏｈｍ之间，为取得一个各物质均 有较强吸收的波长，对各物质进行全波长扫描，确定检测 波长为２７６ｎｍ。 溶剂系统是根据文献报道的各标准物质的溶剂系统 确定，并对几个溶剂系统进行了初步优化筛选。 实验结果表明，不同色谱柱与不同流动相对内标物 与橄榄苦苷的分离度存在较大影响。在不同的色谱条件 下，各标准物质均能与橄榄苦苷完全分离，但考虑到不 同色谱条件下各标准物质的保留时间、能否与溶剂峰分 离、是否受到溶剂峰的影响以及内标物的选择要求等， 为保证内标物与橄榄苦苷有良好的分离度，且不会受到 溶剂峰与不明物质杂质峰的影响，最终选择黄芩苷为内 标物，色谱条件定为色谱柱：Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＩ出ＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃｌ８（４．６Ｘ１５０ｍｍ，５ ｍ），流动相：水一甲醇一甲酸 （６ｏ：４０：１）。 【参考文献】 ［１】赵桂琴．素馨花化学成分及抗ＨＢＶ活性研究【Ｄ］．军事医 学科学院，２００８． ［２】尉小慧，张淑霞，翟卫峰，等．ＨＰＬＣ测定紫丁香树枝中橄 榄苦苷的含量【Ｊ】．中国中药杂志，２００９，３４（３）：３０４－３０６． 【３】彭焕超，张浩，陈雏，等．ＲＰ－－ＨＰＬＣ测定不同来源油橄榄 叶中的橄榄苦苷［Ｊ］．华西药学杂志，２００８，２３（２）：１９９－－－２００． 【４】党建章，许柏球，徐华顺．高效液相色谱法测定橄榄 叶提取物中橄榄苦普的含量【Ｊ］．中国中药杂志，２００６， ４１（９）：７１１－７１２． ［５］刘美兰，杨立新，万元浩等．Ｉ ＨＰＬＣ法测定种药用黄 等中黄等昔和汉黄等普的含量［Ｊ］．药物分析杂志，２００２， ２２（２）：９９－－１０２． 【６】韦建华，李耀华，梁臣艳，等．ＨＰＬＣ测定桑叶配方颗粒中 原儿茶酸、绿原酸和咖啡酸【Ｊ】．中国实验方剂学，２０１１， １７（３）：９３－９５． ［７］沙磊，张兰珍，徐义侠，等．Ｉ Ｐ—ＨＰＬＣ法测定余甘子中诃 黎勒酸、没食子酸、粘酸一２＿＿（）＿＿没食子酸酯的含量［Ｊ］．药 物分析杂志，２０１１，３１（２）：２９３－２９５． （收稿日期：２０ｌ１—０６＿－２８） ・３６３・
