玉竹抑制蛋白质非酶糖基化活性成分研究

玉竹抑制蛋白质非酶糖基化活性成分研究*

王  威，夏  雪，师海波，李红岩，苗艳波

（吉林省中医药科学院，长春  130021）http://www.3722.cn/

[摘要]  目的：研究玉竹抑制蛋白质非酶糖基化有效部位的化学成分，阐明其物质基础。  方法：采用ODS柱色谱对玉竹抑制蛋白质非酶糖基化有效部位进行分离组分的分离，通过牛血清白蛋白-葡萄糖（BSA-Glu）反应体系模型筛选，确定玉竹对蛋白质非酶糖基化抑制作用有效组分。采用ODS柱色谱和制备液相色谱手段对有效组分进行分离，应用包括一维和二维NMR等现代光谱技术鉴定化合物的结构。  结果：采用蛋白质非酶糖基化抑制作用体外模型筛选为指导，从有效组分中分离得到6个化合物，分别鉴定为                3-(4’-hydroxybenzyl)-5,7-dihydroxy-6-methoxy-8-methylchroman-4-one（I）， 3-(4’-hydroxybenzyl)-5,7-dihydroxy-6,8-dimethylchroman-4-one（II），3-(4’-hydroxybenzyl)-5, 6-dimethoxy-7-hydroxy -8-methylchroman-4-one（III），3-乙氧甲基-5,6,7,8-四氢-8-吲哚里嗪酮（3-ethoxymethyl-5,6,7,8-tetrahydroindolizin-8-one，IV），3-异丁基-6-异丙基-1,4-二氧杂环己烷-2,5-二酮（3-isobutyl-6-isopropyl-1,4-dioxane-2,5-dione，V），2-氨基-1-(3,5’-二甲氧基-4’-羟基苯基)-1,3-丙二醇[2-animo-1-(3,5’-dimethoxy-4’-hydroxyphenyl)propane-1,3-diol，VI]。  结论：化合物I、III、V、VI为新化合物，化合物IV为首次从该植物中分离得到，为开发蛋白质非酶糖基化抑制剂提供了有价值的先导化合物和科学依据。

[关键词]  玉竹；蛋白质非酶糖基化；高氢异黄酮

* 国家自然科学基金资助项目（No. 30400587）

糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN）是常见的糖尿病慢性微血管并发症之一，通常是指由于糖尿病引起的肾小球基底膜增厚，系膜扩张以及胞外基质增生，导致肾小球的高滤过和蛋白尿^[1]。已有大量证据表明，持续高血糖引起机体多种蛋白质非酶糖基化，由此形成的非酶糖基化终末产物在糖尿病肾病的发病机制中起重要作用。因此，有效地阻断非酶糖基化反应、抑制非酶糖基化终末产物形成是防治糖尿病肾病发生发展的重要途径^[2]。

玉竹始载于《神农本草经》，列为上品，源于百合科黄精属植物玉竹 Polygonatum odoratum (Mill.) Druce 的干燥根茎。具有养阴润燥，生津止渴之功能，用于肺胃阴伤，燥热咳嗽，咽干口渴，内热消渴。本课题组在对天然产物抑制蛋白质非酶糖基化活性筛选过程中，发现玉竹提取物对蛋白质非酶糖基化具有较强的抑制作用；采用STZ诱导糖尿病大鼠模型研究玉竹乙醇提取物分离部位对肾脏的保护作用，结果表明三氯甲烷分离部位降低糖尿病大鼠血中GHb水平和UAL排泄率，抑制肾皮质AGEs的形成，同时改善肾脏病理改变^[3]。采用牛血清白蛋白-葡萄糖（BSA-Glu）反应体系模型筛选为指导，应用现代色谱和光谱技术从有效部位中分离和鉴定了6个化合物：3-(4’-hydroxybenzyl)-5,7-dihydroxy-6-methoxy-8-methylchroman-4-one（I）， 3-(4’-hydroxybenzyl)-5,7-dihydroxy-6,8-dimethylchroman-4-one（II），3-(4’-hydroxybenzyl)-5, 6-dimethoxy-7-hydroxy -8-methylchroman-4-one（III），3-乙氧甲基-5,6,7,8-四氢-8-吲哚里嗪酮（3-ethoxymethyl-5,6,7,8-tetrahydroindolizin-8-one，IV），3-异丁基-6-异丙基-1,4-二氧杂环己烷-2,5-二酮（3-isobutyl-6-isopropyl-1,4-dioxane-2,5-dione，V），2-氨基-1-(3,5’-二甲氧基-4’-羟基苯基)-1,3-丙二醇[2-animo-1-(3,5’-dimethoxy-4’-hydroxyphenyl)propane-1,3-diol，VI]。

1  仪器与材料

Yanako显微熔点测定仪（温度计未校正）；BRUKER AV-500型核磁共振波谱仪；Finnigan LCQ^TM离子阱质谱仪；输液泵NPL-500，日本精密科学株式会社；示差折光检测器RI-102，日本昭光电工株式会社。SHY-2型水浴恒温振荡器，江苏金城国胜实验仪器厂；960MC型荧光分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司。制备高效液相色谱柱： Shim-pack PREP-ODS（H）KIT column（φ20×250 mm）No. 20253393；Senshu Pak C₆H₅-3152-N column（φ8×150mm）No. 03202；Kaseisorb LC ODS Super column（φ10×250mm）No. 8155147。柱色谱用十八烷基键合硅胶[ODS（PEGASIL PREP ODS-5015-12A）]，日本Senshu科学株式会社；薄层色谱用硅胶板（Silica gel 60 F₂₅₄），ODS板（RP-18 F₂₅₄），德国Merck公司。盐酸氨基胍，Fluka公司；牛血清白蛋白，北京鼎国生物技术有限责任公司；D-葡萄糖，Sigma公司。氘代甲醇，日本和光纯药工业株式会社；甲醇为色谱纯，美国FISHER公司；水为超滤水；其它试剂均为分析纯。

玉竹药材购于吉林省宏检医药物资经销公司，经长春中医药大学李文亭教授鉴定为百合科黄精属植物玉竹Polygonatum odoratum (Mill.) Druce的干燥根茎。

2  实验方法

2.1 蛋白质非酶糖基化抑制活性测定方法

在牛血清白蛋白10 mg/mL和葡萄糖200 mmol/L磷酸盐缓冲液（200 mmol/L，pH 7.4）的蛋白质非酶糖基化体系中分别加入供试品500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL（sample），氨基胍0.3125 mmol/L作为阳性对照（positive sample），牛血清白蛋白10mg/ml和葡萄糖200mmol/L磷酸盐缓冲液的蛋白质非酶糖基化体系作为对照（control），加入供试品的牛血清白蛋白10 mg/mL磷酸盐缓冲液作为空白A（blank A），牛血清白蛋白10 mg/mL磷酸盐缓冲液作为空白B（blank B），于37℃孵育7天后，采用荧光分光光度计在370/440nm波长处测定荧光值，按下式计算抑制率。

抑制率% = [1-（Sample-Blank A）/（Control-BlankB）]×100%

2.2 总提取物的提取与分离部位的分离

取玉竹药材59kg，加10倍量乙醇回流提取二次，每次2小时，滤过，提取液减压回收乙醇，减压干燥得总提取物10.4kg（收率17.62%）。取总提取物7.85kg，加水使溶解，依次用三氯甲烷、正丁醇振摇提取，提取液减压回收，得三氯甲烷分离部位250g、正丁醇分离部位600g。

2.3 分离组分的分离

取三氯甲烷有效部位40 g，加甲醇溶解得甲醇可溶部27.4g。经十八烷基键合硅胶柱色谱，以甲醇-水（7：3，9：1，10：0）梯度洗脱，得23个分离组分Fr. YZ-1（12.6679 g），YZ-2（2.7417 g），YZ-3（501.4 mg），YZ-4（424.4 mg），YZ-5（575.9 mg），YZ-6（358.3 mg），YZ-7（440.3 mg），YZ-8（230.3 mg），YZ-9（315.2 mg），YZ-10（4.8 mg），YZ-11（156.5 mg），YZ-12（388.7 mg），YZ-13（86.8 mg），YZ-14（581.4 mg），YZ-15（799.5 mg），YZ-16（627.5 mg），YZ-17（173.2 mg），YZ-18（186.5 mg），YZ-19（265.6 mg），YZ-20（392.9 mg），YZ-21（539.2 mg），YZ-22（17.3 mg），YZ-23（305.0 mg）。

2.4 有效组分的分离

Fr. YZ-2经十八烷基键合硅胶柱色谱，以甲醇-水（4：6，6：4，10：0）洗脱得Fr. YZ-2-1（1.0107 g），YZ-2-2（113.5 mg），YZ-2-3（184.7 mg），YZ-2-4（180.4 mg），YZ-2-5（48.7 mg），YZ-2-6（137.1 mg），YZ-2-7（170.9 mg），YZ-2-8（92.9 mg），YZ-2-9（67.5 mg），YZ-2-10（61.6 mg），YZ-2-11（225.5 mg），YZ-2-12（274.7 mg），YZ-2-13（126.7 mg）；YZ-2-3经制备高效液相色谱（色谱柱：Shim-pack PREP-ODS（H）KIT，φ20×250mm；流动相：甲醇-水=35：65；流速：2.8 ml·min^-1；检测器：示差折光检测器RI）得化合物IV（5.9 mg）和V（3.1 mg）；YZ-2-6经制备高效液相色谱（色谱柱：Senshu Pak C₆H₅-3152-N，φ8×150mm；流动相：甲醇-水=35：65；流速：1.5 ml·min^-1；检测器：示差折光检测器RI）得化合物VI（6.0 mg）。Fr. YZ-3经制备高效液相色谱（色谱柱：Kaseisorb LC ODS Super，φ10×250mm；流动相：甲醇-水=60：40；流速：1.5 ml·min^-1；检测器：示差折光检测器RI）得化合物I（160.4 mg）。Fr. YZ-4经制备高效液相色谱（色谱柱：Kaseisorb LC ODS Super，φ10×250mm；流动相：甲醇-水=60：40；流速：1.5 ml·min^-1；检测器：示差折光检测器RI）得化合物II（112.2 mg）。Fr. YZ-5经制备高效液相色谱（色谱柱：Kaseisorb LC ODS Super，φ10×250mm；流动相：甲醇-水=70：30；流速：1.5 ml·min^-1；检测器：示差折光检测器RI）得化合物III（67.2 mg）。

3  实验结果

3.1 不同分离组分对蛋白质非酶糖基化抑制作用

不同浓度分离组分对蛋白质非酶糖基化抑制率见表1。结果表明分离组分Fr. YZ-2~ Fr. YZ-9对蛋白质非酶糖基化反应有明显地抑制作用。http://www.3722.cn/

表 1  玉竹有效部位不同分离组分对蛋白质非酶糖基化的抑制作用